此前，艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)通過多期軟文與視頻，分析了生物系統(tǒng)中緩沖鹽的重要作用，特定制劑（如mRNA-LNP）中緩沖液的篩選考量，并簡(jiǎn)要介紹了緩沖鹽在冷凍/凍干狀態(tài)下pH值變化趨勢(shì)的相關(guān)研究。

本期，艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)延續(xù)這一話題，對(duì)應(yīng)用較廣的緩沖體系之一——磷酸鹽緩沖體系（PBS）進(jìn)行深入分析。

在與眾多業(yè)內(nèi)專業(yè)人員溝通過程中，很多人反饋磷酸鹽緩沖體系用于冷凍或凍干劑型時(shí)穩(wěn)定性結(jié)果不佳，懷疑可能存在比較劇烈的pH改變。

為此，艾偉拓產(chǎn)品團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了文獻(xiàn)調(diào)研，本期通過分享一篇來(lái)自美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)藥學(xué)院研究者的論文，探討磷酸鹽緩沖液(PBS)冷凍狀態(tài)下pH的變化情況、原因以及應(yīng)對(duì)策略。

01 介紹

磷酸鹽緩沖液(PBS)被較廣用作冷凍保存和生物藥物的開發(fā)生產(chǎn)中，也被用于凍干生物制劑和診斷試劑。

PBS(通常稱為PBS 1X)緩沖液含有氯化鈉(137 mM)、磷酸氫二鈉(8.1 mM)、氯化鉀(2.7 mM)和磷酸二氫二鉀(1.5 mM)。

當(dāng)磷酸鹽溶液冷卻時(shí)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O)的結(jié)晶會(huì)導(dǎo)致冷凍濃縮物的pH值發(fā)生明顯的變化。如果在PBS溶液冷卻時(shí)觀察到類似的pH值變化，則可能對(duì)生物制劑的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。

02 冷凍PBS溶液的表征

（1）低溫pH值測(cè)量

當(dāng)PBS溶液從20℃冷卻到-25℃時(shí)，pH值變化約4.3個(gè)單位(圖1a)。根據(jù)先前對(duì)磷酸鈉緩沖液(由磷酸和磷酸氫二鈉組成)的研究，這種pH值的變化是由于十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O)結(jié)晶所致。由于PBS中含有NaCl和KCl，因此確定這些鹽對(duì)緩沖溶液相行為的影響是很有意義的。

將only含有氯化鉀或氯化鈉其中一種鹽的磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀)溶液冷卻，并測(cè)量pH值(圖1c、d)，均檢測(cè)到pH值變化。

單獨(dú)的磷酸緩沖溶液，即不添加鹽，也表現(xiàn)出了接近PBS溶液的pH位移(~ 3.8個(gè)單位)(圖1b)。

圖1 四種溶液冷凍50分鐘，隨后在-25℃保持冷凍，測(cè)量其pH(右y軸，紅色曲線)和溫度(左y軸，黑色曲線)的變化情況；(a) PBS溶液，(b)磷酸鈉緩沖液(濃度與PBS中相同)，(c)磷酸鈉緩沖液+氯化鈉(濃度與PBS中相同)，(d)磷酸鈉緩沖液+氯化鉀(濃度與PBS中相同)。

（2）低溫XRD（X射線衍射）

將PBS溶液從室溫冷卻至-40℃，在預(yù)定溫度下記錄XRD圖譜(圖2a)。在-15℃時(shí)，冰和磷酸氫二鈉明顯結(jié)晶。

在低溫pH測(cè)量中觀察到，在-15℃左右時(shí)pH值明顯下降，這是由于磷酸氫二鈉的選擇性結(jié)晶(圖1)。氯化鈉和氯化鉀的結(jié)晶分別在-25℃和-35℃左右時(shí)觀察到。沒有發(fā)現(xiàn)磷酸二氫鉀結(jié)晶的證據(jù)。因此，十二水合磷酸氫二鈉、二水合氯化鈉和氯化鉀依次從PBS溶液結(jié)晶。

當(dāng)冷凍PBS溶液從-40℃加熱到室溫時(shí)，氯化鉀(-23℃)和二水合氯化鈉(-21℃)的峰依次消失(圖2b)。即使在-5℃時(shí)，也可以觀察到十二水磷酸氫二鈉的峰(圖2b)。

圖2 冷凍PBS水溶液的XRD圖譜。將溶液從室溫冷卻到-40℃，然后加熱到-5℃(冷卻和加熱速度均為1℃/min)。(a)在0、-5、-10、-15、-21、-23、-25、-35和-40℃下的冷卻和(b)在-40、-35、-25、-23、-21、-15、-10和-5℃下的加熱過程中記錄的XRD圖譜疊加。

（3）冷凍PBS的熱力學(xué)分析

在冷凍PBS的DSC加熱曲線上觀察到三個(gè)吸熱峰，在-24.3℃和-22.1℃有兩個(gè)重疊的吸熱峰(圖3)。

在-24.3℃時(shí)的吸熱可歸因于氯化鈉-氯化鉀-冰共晶的熔化。二水合氯化鈉-冰共晶在-22.1℃發(fā)生熔化。如前所述，XRD通過氯化鉀(?23℃)和氯化鈉二水合物(?21℃)峰的消失提供了支持證據(jù)(圖2b)。較后，在-0.3℃下觀察冰融化吸熱。

圖3 冷凍PBS溶液的DSC加熱曲線。將溶液以5℃/min的速度從室溫冷卻至-60℃，保持10 min，然后以1℃/min的速度加熱至室溫。只顯示了較終的加熱曲線。插圖顯示了兩個(gè)共晶熔化峰的重疊。

03 含共溶溶質(zhì)（海藻糖，甘露醇）的冷凍PBS溶液的表征

（1）低溫pH值測(cè)量

海藻糖(5% w/v, 146 mM)或甘露醇(1% w/v, 55 mM)的加入導(dǎo)致PBS中pH值變化幅度突出降低。海藻糖存在時(shí)為1.6個(gè)單位(圖4a)，甘露醇存在時(shí)為1.7個(gè)單位(圖4b)。

圖4 冷凍50分鐘，隨后在-25℃保持冷凍的pH(右y軸)和溫度(左y軸)的變化情況；(a)含有海藻糖(5% w/v)的PBS，(b)含有甘露醇(1%w/v)的PBS。

（2）低溫XRD

當(dāng)含有海藻糖(5% w/v)的PBS溶液冷凍至-40℃，然后加熱至-5℃時(shí)，只有冰結(jié)晶，沒有緩沖鹽結(jié)晶的證據(jù)(圖5)。

圖5 含海藻糖(5% w/v)的冷凍PBS水溶液的XRD圖譜。將溶液從室溫冷卻到-40℃，然后加熱到-5℃(冷卻和加熱速度均為1℃/min)。(a)0、-5、-10、-15、-21、-23、-25、-35和-40℃下冷卻時(shí)記錄的XRD圖譜疊加，以及(b)在-40、-35、-25、-23、-21、-15、-10和-5℃下加熱時(shí)記錄的XRD圖譜疊加。

當(dāng)含有甘露醇(1% w/v)的PBS溶液冷卻時(shí)，在-35℃下觀察到十二水合磷酸氫二鈉和二水合氯化鈉的結(jié)晶(圖6a)。在沒有甘露醇的情況下，緩沖鹽在-15℃時(shí)首先明顯結(jié)晶(圖2a)。因此，在甘露醇的存在下，緩沖鹽的結(jié)晶被較大延遲。此外，十二水磷酸氫二鈉峰的強(qiáng)度要低得多。該結(jié)果為甘露醇對(duì)磷酸氫二鈉結(jié)晶的抑制作用提供了直接證據(jù)。

甘露醇還能抑制氯化鈉的結(jié)晶。甘露醇存在時(shí)二水合氯化鈉峰的強(qiáng)度遠(yuǎn)小于不存在甘露醇時(shí)的強(qiáng)度。PBS中其他溶質(zhì)的結(jié)晶，即氯化鉀和磷酸鉀沒有觀察到，也沒有甘露醇結(jié)晶的證據(jù)。

當(dāng)冷凍溶液加熱時(shí)，二水合氯化鈉的峰在-25℃時(shí)消失(圖6b)，這與DSC中觀察到的二水合氯化鈉-冰共晶熔化溫度(-25.2℃)接近。由于在冷卻過程中沒有氯化鉀結(jié)晶的證據(jù)，因此可以合理假設(shè)甘露醇抑制了KCl的結(jié)晶。如果冷凍濃縮物中保留了氯化鉀，則不會(huì)形成二水合氯化鈉-氯化鉀-水三元體系。甘露醇完全抑制二水氯化鈉-氯化鉀-水三元共晶，部分抑制二水氯化鈉-水三元共晶。在進(jìn)一步加熱冷凍溶液后，無(wú)水α-和β-甘露醇以及半水合甘露醇在-15℃下結(jié)晶(圖6b)。

較后，甘露醇峰在?2℃時(shí)消失，這與甘露醇共晶熔化溫度?1.5℃非常吻合。十二水磷酸氫二鈉峰在-1℃時(shí)消失(圖6b)，再次與十二水磷酸氫二鈉-水共晶熔融溫度(-0.5℃)非常吻合。

圖6 含甘露醇 (1% w/v)PBS冷凍水溶液的XRD譜圖。將溶液從室溫冷卻至-40℃，然后加熱至0℃(冷卻和加熱速率均為1℃/min)，并在幾個(gè)選定的溫度下收集冷卻和加熱過程中的XRD圖譜。(A)冷卻和(B)加熱時(shí)記錄的XRD圖譜疊加圖。

（3）熱力學(xué)分析

當(dāng)冷凍溶液被加熱時(shí)，共晶熔化被抑制，甘露醇部分抑制，海藻糖完全抑制（見下表3）。

總體而言，添加海藻糖(5% w/v)可以完全抑制PBS的氯化鈉結(jié)晶，而添加甘露醇(1% w/v)可以部分抑制PBS的氯化鈉結(jié)晶。由于冷凍過程中的共晶結(jié)晶會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，在冷凍保存中，使用海藻糖等添加劑提供了完全抑制鹽結(jié)晶的途徑。

04 凍干產(chǎn)物的特征

當(dāng)PBS被冷凍干燥時(shí)，較終的凍干產(chǎn)物顯示出歸因于氯化鈉、無(wú)水磷酸氫二鈉和氯化鉀的峰(圖7)。在冷凍溶液中，氯化鈉和磷酸氫二鈉已經(jīng)結(jié)晶為水合物。在干燥過程中，它們轉(zhuǎn)化為各自的無(wú)水結(jié)晶形式。

PBS與甘露醇(1% w/v)冷凍干燥得到結(jié)晶甘露醇(α-和β-形式)，以及氯化鈉、無(wú)水磷酸氫二鈉和氯化鉀(圖7)。更早的時(shí)候，在冷凍溶液中，觀察到甘露醇的一部分是半水合物(圖6b)。干燥過程中完成了半水到無(wú)水的過渡。

海藻糖抑制了體系中所有溶質(zhì)的結(jié)晶。所有溶質(zhì)在較終的凍干產(chǎn)物中都保持無(wú)定形。這一觀察結(jié)果與磷酸鹽+海藻糖溶液凍干后得到的結(jié)果一致。

圖7 PBS溶液、含甘露醇(1% w/v)的PBS和含海藻糖(5% w/v)的PBS凍干得到的粉末XRD譜圖。鑒定了磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、α-甘露醇和β-甘露醇的特征峰。

05 重要性

當(dāng)磷酸鹽緩沖溶液（PBS）冷卻時(shí)，其中一種緩沖成分的選擇性結(jié)晶會(huì)在部分冷凍的溶液中引起明顯的pH值變化。鑒于PBS在生物醫(yī)藥、細(xì)胞保存和診斷制劑中的較廣使用，這一信息具有巨大的實(shí)際重要性。

緩沖溶液的目標(biāo)是在一個(gè)狹窄的范圍內(nèi)維持pH值。因此，觀察到的鹽結(jié)晶和隨之產(chǎn)生的pH值變化，可能對(duì)系統(tǒng)中活性成分的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。

該研究通過測(cè)量pH值和監(jiān)測(cè)溶液中結(jié)晶的相來(lái)表征緩沖鹽在冷凍PBS溶液中的結(jié)晶，分析了PBS在海藻糖和甘露醇這兩種常用輔料存在下的冷凍行為。

單獨(dú)的PBS溶液在冷凍時(shí)，表現(xiàn)出明顯的pH值變化(3~4個(gè)單位)，PBS中加入結(jié)晶(甘露醇)或非結(jié)晶(海藻糖)溶質(zhì)后，pH值變化幅度明顯降低(pH值變化only為~ 1.7個(gè)單位)。因此，這些輔料提供了一種抑制冷凍PBS溶液pH值變化的途徑。

海藻糖的存在抑制了二水合物氯化鈉-水共晶的結(jié)晶。這可能有利于低溫保存，因?yàn)榧?xì)胞損傷與共晶結(jié)晶有關(guān)。

06 冷凍或凍干制劑中使用PBS的考量

基于該研究，在冷卻過程中，PBS的pH值明顯降低(~4.3單位)。在PBS中加入海藻糖或甘露醇作為溶質(zhì)，將pH值的變化幅度降低到~1.7個(gè)單位。甘露醇部分抑制PBS組分的結(jié)晶，而海藻糖可以抑制PBS體系中所有溶質(zhì)的結(jié)晶。

那么，對(duì)于某個(gè)具體的冷凍或凍干劑型的制劑，是否可以選用PBS作為緩沖體系呢？

筆者認(rèn)為可以按照以下步驟進(jìn)行考量：

①prescription篩選階段，比較PBS與其他候選緩沖體系，測(cè)量換用不同緩沖體系時(shí)，制劑prescription在冷凍狀態(tài)下的pH變化值

②結(jié)合已上市制劑prescription信息與篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，評(píng)估活性成分（如抗體蛋白，mRNA-LNP）在該pH變化幅度下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性

③若pH變化突出影響制劑中活性成分穩(wěn)定性，建議棄用PBS，換用其他生物緩沖體系（如組氨酸，Tris，HEPES等）

④若影響在可接受范圍內(nèi)，出于生產(chǎn)或?qū)徟蚱渌蛩貎A向于選擇PBS，建議制劑prescription中選用海藻糖作為低溫保護(hù)劑，抑制PBS冷凍時(shí)的溶質(zhì)結(jié)晶，提升制劑穩(wěn)定性。