一、輝瑞/BioNTech在新冠mRNA疫苗生產(chǎn)過程中使用RNase free的HEPES

輝瑞/BioNTech新冠疫苗EMA審評報告中的“制造過程和過程控制的描述”部分提到，BNT162b2活性物質(zhì)的制造過程包括五個主要步驟。RNA分子通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）步驟從線性DNA合成，IVT步驟之后是多步凈化和過濾。最后，RNA經(jīng)過最后的過濾并被分裝并冷凍儲存。

報告建議申請人實施相關(guān)測試策略，以確保對起始材料進行充分的微生物控制，同時確保包含在FP的緩沖液配方中的HEPES（輝瑞）原材料不含RNA酶污染。

而在報告的“產(chǎn)品的制造和過程控制”下的“輔料控制”部分提到，加工助劑乙醇和檸檬酸緩沖液按Ph. Eur標準控制。HEPES和EDTA的標準參照活性物質(zhì)制定。

由以上內(nèi)容可知，輝瑞/BioNTech在新冠mRNA疫苗的生產(chǎn)過程中使用到HEPES，同時審評報告反復(fù)強調(diào)了該輔料的無RNase的關(guān)鍵屬性。

結(jié)合2016年BioNTech發(fā)表LPX-mRNA制劑的文章中mRNA原液中所采用的buffer為HEPES，基本可以推斷BioNTech采用HEPES作為原液中的buffer且已獲批上市的新冠疫苗原液采用HEPES作為緩沖對。

二、HEPES作為IVT反應(yīng)buffer的相關(guān)研究

mRNA原液中采用HEPES作為buffer可能與前一步RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。

早在1987年便有研究報道使用HEPES緩沖對用于體外轉(zhuǎn)錄，在該研究中考察了不同反應(yīng)條件下IHNV（感染性造血壞死病毒）的 RNA 聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄，研究結(jié)果表明對比Tris，使用HEPES緩沖液可以最大限度地提高體外轉(zhuǎn)錄（IVT）效率。

該研究中對緩沖條件的研究表明，HEPES緩沖液刺激的RNA合成量比Tris緩沖液高三倍（圖1 a），最佳濃度的HEPES緩沖液為400mM。

英國帝國理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院傳染病系系主任Robin Shattock是mRNA預(yù)防性疫苗領(lǐng)域的權(quán)威專家，與BioNTech以及PNI等公司都有較為密切的合作。其團隊2021年發(fā)表關(guān)于saRNA體外轉(zhuǎn)錄體系優(yōu)化的文章中，考察篩選了影響saRNA體外轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵影響因素，最終確定了采用40mM濃度的HEPES作為IVT反應(yīng)體系buffer，具有更優(yōu)的體外轉(zhuǎn)錄效果。

2016年BioNTech發(fā)表LPX-mRNA制劑的文章中mRNA原液中所采用的buffer為HEPES。該研究中使用HEPES緩沖液配置1mg/ml的RNA原液，用于進一步制備RNA-LPX。

HEPES作為IVT反應(yīng)體系buffer具有優(yōu)勢，這是我們結(jié)合相關(guān)文獻，推斷BioNTech采用HEPES緩沖對作為mRNA原液buffer的原因。

三、HEPES相較于其他緩沖體系較為突出的特點

1、pKa隨溫度變化非常小，buffer的pH值隨溫度漂移很小。

2、性質(zhì)穩(wěn)定，HEPES不會與其他離子發(fā)生相互作用，一方面HEPES不會與其他離子發(fā)生絡(luò)合影響其他離子功能，另外一方面其他離子的存在不會影響HEPES的緩沖能力。

3、細胞培養(yǎng)基中pH的維持主要依靠培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽和5%的CO2共同維持，當細胞處于開放環(huán)境時，CO2逸散會導(dǎo)致pH快速上升脫離生理pH范圍，而添加HEPES緩沖對的培養(yǎng)基則不存在這方面問題。

4、HEPES不易穿過生物膜，不干擾細胞內(nèi)的生化反應(yīng)。

四、使用HEPES緩沖體系時的注意事項

1、由于哌嗪基團的存在，當HEPES暴露于光線中時，會產(chǎn)生H2O2，這對培養(yǎng)的細胞或其它有生物活性的物體產(chǎn)生毒性，同時對氧化還原敏感的物質(zhì)不宜共同使用，因此HEPES作為緩沖液的操作應(yīng)盡量在避光條件下進行。

2、HEPES在生化領(lǐng)域常見的使用濃度為10-25mM，當濃度低于10mM時緩沖能力較弱，不能起到較好的緩沖效果，當濃度較高時對一些細胞可能具有毒害作用。

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