當前的COVID-19疫情極大地加速了mRNA技術(shù)在我們現(xiàn)實世界中的應(yīng)用，在這場戰(zhàn)斗中，mRNA證明了它與傳統(tǒng)生物制藥和疫苗技術(shù)相比的獨特優(yōu)勢。為了克服人體生理環(huán)境中mRNA的不穩(wěn)定性，mRNA的納米遞送系統(tǒng)是其體內(nèi)應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。納米遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)遞送系統(tǒng)（脂質(zhì)納米顆粒和脂質(zhì)體）、聚合物復(fù)合物、膠束、陽離子肽等。總而言之，mRNA的應(yīng)用范圍很廣，它的時代才剛剛開始。

一、 為什么需要納米遞送系統(tǒng)？

核酸的分子量比較大（104-106 Da）并且?guī)в胸撾姾?，因此很難通過細胞的陰離子脂質(zhì)雙層膜，此外，由于mRNA是單鏈大分子，較為脆弱，細胞外的存在也會限制mRNA的傳遞，例如被先天免疫系統(tǒng)中的吞噬細胞所吞噬或者被核酸酶降解，都會導(dǎo)致靶細胞攝取效率低，體內(nèi)釋放不成功等問題。電穿孔、基因槍以及離體轉(zhuǎn)染可以向培養(yǎng)皿中的細胞遞送mRNA，然而，在實際人體中遞送時，則需要納米遞送系統(tǒng)，用以避免毒性以及不必要的免疫原性。

幸運的是，為了實現(xiàn)mRNA的有效遞送已經(jīng)開發(fā)了許多基于材料的創(chuàng)新解決方案。目前最常用的納米遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）、脂質(zhì)體、脂質(zhì)復(fù)合物、高分子聚合物、膠束、多肽、魚精蛋白、電穿孔等。LNPs和脂質(zhì)體是最有前途的mRNA遞送工具之一。

二、 納米遞送系統(tǒng)

圖1.mRNA的遞送系統(tǒng)及應(yīng)用

2.1 脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）

圖2.LNP結(jié)構(gòu)示意圖

LNPs目前是基因治療的主要非病毒遞送載體。隨著LNP介導(dǎo)的siRNA治療劑Onpattro® (patisiran)獲批上市，mRNA遞送領(lǐng)域最先想到的就是采用LNPs遞送。 如圖所示：LNPs是一種具有磷脂單層結(jié)構(gòu)的生物相容性載體，可以將mRNA包裹在核中以避免降解。除了帶負電荷的mRNA外，LNP通常還有其他四種成分：可電離的陽離子脂質(zhì)、中性輔助磷脂、膽固醇和PEG化脂質(zhì)。

中性輔助磷脂一般為飽和磷脂，可提高整體相變溫度和穩(wěn)定性。

膽固醇具有很強的膜融合能力，促進細胞內(nèi)mRNA的攝入和細胞質(zhì)的進入。

PEG化脂質(zhì)位于其表面以提高其親水性，避免被免疫系統(tǒng)快速清除，防止顆粒聚集，增加穩(wěn)定性。

可電離的陽離子脂質(zhì)，它是mRNA遞送和轉(zhuǎn)染效率的決定性因素。它需要在生理條件下（pH≈7.0）非電離，但在酸性條件下電離（pH=5.0）。此時叔胺頭部質(zhì)子化，形成離子化頭部和疏水鏈尾部，進而形成錐形結(jié)構(gòu)，促進內(nèi)涵體/溶酶體膜向六方晶相轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)高效遞送和轉(zhuǎn)染。羧酸酯的存在保證了陽離子脂質(zhì)在體內(nèi)的可降解性，避免了脂質(zhì)聚集帶來的毒副作用。

LNP可通過快速混合進行制備，目前主流的方法是通過微流體制備，將含有mRNA的乙醇溶液添加到過量的水中，然后與脂質(zhì)迅速混合，自組裝包裹mRNA后形成納米顆粒。

目前上市的兩款mRNA新冠疫苗使用的就是LNP遞送mRNA。

表1.兩款mRNA新冠疫苗LNP組分對比

除了上述兩款上市mRNA新冠疫苗中的兩款LNP，還有許多新型LNP在研發(fā)階段且極具價值。不同的材料對LNP的性質(zhì)有很大的影響。

l Aguado課題組開發(fā)了四種具有不同成分的LNP用于mRNA遞送，并且通過對比，DOTAP作為陽離子脂質(zhì)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，并且伴隨著多糖的加入而提高了穩(wěn)定性。

表2.不同配方的四種LNP

圖3.三種陽離子結(jié)構(gòu)

l Davies課題組則發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)皮下注射含有mRNA的LNP時，可以在血漿中產(chǎn)生可測量的分泌蛋白，但會受到相關(guān)炎癥因子的影響。 為了克服這一局限，構(gòu)建了由MC3陽離子脂質(zhì)和L608陽離子脂質(zhì)組成的LNPs，其蛋白表達持續(xù)時間延長，可實現(xiàn)慢性病治療性蛋白的系統(tǒng)水平穩(wěn)定。

圖4.MC3和L608陽離子脂質(zhì)結(jié)構(gòu)

l Billingsley課題組研究了靶向治療嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）的療效，該療法具有誘導(dǎo)急性淋巴細胞白血病和B細胞淋巴瘤患者緩解的能力。然而，使用病毒載體可以誘導(dǎo)永久性的CAR表達，這可能會導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)。因此為了降低不良反應(yīng)的毒性，他們設(shè)計了LNP用作mRNA體外遞送到人體T細胞中，并從24個可溶性脂質(zhì)庫中發(fā)現(xiàn)7種能增強療效緩解癥狀的LNP。

圖5.A烷基鏈；B篩選庫；C合成反應(yīng)

除此以外，還有更多課題組致力于LNP的研發(fā)，不同的LNP具有不同的靶向和效果，甚至有課題組設(shè)計研發(fā)出可霧化的脂質(zhì)納米顆粒，用于肺部的疾病治療。

雖然LNP是mRNA遞送的最有效手段之一，但存在幾乎無窮無盡的設(shè)計空間，需要耗費大量人力物力及時間成本對其進行修改，以實現(xiàn)高效，無毒的靶向特定組織，器官或細胞的LNP制劑。此外，穩(wěn)定性差使得mRNA-LNP的運輸和儲存成本很高。它的長期存儲也是發(fā)展mRNA-LNP體系需要重點考慮的問題之一。

2.2 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由磷脂雙層形成的球形封閉囊泡。脂質(zhì)體由A. D. Bangham于1965年首次發(fā)現(xiàn)，并長期用于小分子藥物遞送，粒徑范圍為20nm至1000nm。除了小分子化療藥物的封裝外，越來越多的研究集中在基因藥物（包括mRNA，pDNA，siRNA等），蛋白質(zhì)藥物，激素藥物等脂質(zhì)體的封裝和遞送能力上。陽離子脂質(zhì)體帶正電荷，主要由陽離子脂質(zhì)組成，陽離子脂質(zhì)能夠以靶向方式有效地濃縮核酸。此外，通過改變陽離子脂質(zhì)體的物理和化學(xué)性質(zhì)，例如調(diào)整粒徑的大小和修飾陽離子脂質(zhì)體的表面，可以在體內(nèi)獲得良好的藥代動力學(xué)性質(zhì)。一般來說，脂質(zhì)體的制備方法包括薄膜分散法、溶劑注射法、冷凍干燥法、pH梯度法等

圖6.陽離子脂質(zhì)體包封mRNA的結(jié)構(gòu)示意圖

目前用于制備脂質(zhì)體的材料眾多，包含特殊的陽離子脂質(zhì)，磷脂以及實現(xiàn)脂質(zhì)體隱形的PEG化脂質(zhì)。

表3.用于mRNA遞送的脂質(zhì)體常用材料

通過脂質(zhì)體遞送mRNA有許多優(yōu)點。首先，脂質(zhì)體是球形囊泡，可以封裝mRNA并抵抗核酸酶。其次，脂質(zhì)體與細胞膜相似，易于與受體細胞融合，轉(zhuǎn)染效率高。第三，作為一種遞送系統(tǒng)，脂質(zhì)體不受宿主限制。最后，磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)高度模擬細胞膜。它是生物進化理論中已知的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)異的長期儲存穩(wěn)定性。

l Miche課題組通過薄膜分散法制備陽離子脂質(zhì)體，并包封mRNA。脂質(zhì)體由DC-CHOL / DOPE組成，該制劑即使在室溫下儲存80 d仍可以保持穩(wěn)定。

l Kuznetsova課題組利用三苯基膦，采用非共價手段修飾后DPPC脂質(zhì)體。與十四烷基咪唑烴尾表面活性劑相比，脂質(zhì)體可以維持4個月以上的穩(wěn)定性。

l Mai課題組通過薄膜分散法制備了由DOTAP/CHOL/DSPES-PEG組成的陽離子脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體，mRNA和魚精蛋白以10：1：1的比例混合，形成了穩(wěn)定的脂質(zhì)體/魚精蛋白-mRNA復(fù)合物。通過鼻腔給藥，該脂質(zhì)體核酸藥物顯示出極大的效率和刺激樹突狀細胞成熟的能力，并可以進一步誘導(dǎo)強烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

l Zhang R課題組用膽固醇修飾的陽離子多肽DP7對DOTAP脂質(zhì)體進行了修飾。修飾后的DOTAP脂質(zhì)體具有了跨膜結(jié)構(gòu)和免疫輔助功能，同時也提高了個性化新抗原mRNA遞送的效率，并增強了激活樹突狀細胞（DC）的能力。

l Huang H課題組首先利用脂質(zhì)體包裹了編碼RBD區(qū)域的mRNA，該mRNA脂質(zhì)體復(fù)合物可以在體內(nèi)表達RBD并成功誘導(dǎo)接種小鼠產(chǎn)生針對SARS-CoV-2的特異性抗體，有效的中和了SARS-CoV-2假型病毒。

然而，盡管mRNA已經(jīng)成功地通過脂質(zhì)體遞送，但脂質(zhì)體也有一些缺點。與LNP相比，脂質(zhì)體制備和mRNA包封的生產(chǎn)過程要復(fù)雜得多。一般來說，LNP和脂質(zhì)體都是脂質(zhì)納米顆粒。它們有許多相似之處，也有很大的不同之處。

表4.LNP和Liposome異同之處

2.3 聚合物復(fù)合物

高分子量聚合物材料（分子量10-106）化合物，通常是通過簡單結(jié)構(gòu)單元之間的共價鍵反復(fù)連接形成叫高分子量的復(fù)合物，例如殼聚糖，聚乙烯亞胺，聚氨酯等。大多數(shù)用于mRNA遞送的聚合物材料需要通過修飾以提高其轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性。聚乙烯亞胺（PEI）系統(tǒng)成功地將mRNA遞送到細胞和鼻腔內(nèi)。

l Soliman課題組通過靜電絡(luò)合作用制備了含有mRNA的納米顆粒，其由不同程度的脫乙?；突腔叻肿咏M成。結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸和殼聚糖的聚合物長度和電荷密度，直接影響了與mRNA的親和力及其轉(zhuǎn)染效率

l Choia課題組則報道了一種mRNA遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用的是氧化石墨烯（GO）-聚乙烯亞胺（PEI）復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)GO-PEI復(fù)合物對于mRNA的有效負載以及保護mRNA免受核酸酶的降解非常有效。GO-PEI/RNA復(fù)合物處理細胞的動態(tài)懸浮培養(yǎng)顯著提高了重編程效率。

l Chiper課題組通過化學(xué)修飾伯胺到芳香族結(jié)構(gòu)域，制備了1.8 kDa的聚乙烯亞胺（PEI）顆粒。這種修飾不僅不會影響聚乙烯亞胺的緩沖能力，還可以增強其pH敏感聚集，穩(wěn)定細胞外復(fù)合物，同時仍然允許核酸進入細胞后有效釋放。

圖7. Chiper課題組化學(xué)修飾PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 膠束

膠束是指在表面活性劑濃度達到水溶液中一定值后開始大量形成的有序分子聚集體。在膠束中，表面活性劑分子的疏水基團聚集形成膠束的核心，親水極性基團形成膠束的外層。

l Roloff 課題組研究了一種新型RNA聚合物兩親性分子組裝成球形膠束，直徑約為15-30nm，研究證明它們可以在不使用轉(zhuǎn)染試劑的情況下有效地進入活細胞。

圖8. Roloff 課題組研發(fā)的膠束

l Chan課題組則提出使用專門定制的多鏈氨基酸將mRNA靜脈遞送到小鼠的大腦中。這種結(jié)構(gòu)最終將凝結(jié)成一個介于24至34nm之間的多鏈納米。然后，熒光素酶（Luc2）的mRNA作為報告基因通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）并隨后通過腦室內(nèi)（ICV）注射將多鏈氨基酸注入小鼠大腦以繞過血腦屏障（BBB）。研究顯示，多重鏈納米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較好的mRNA遞送效率，并且沒有顯著的免疫應(yīng)答記錄，可應(yīng)用于腦部疾病的治療。

2.5 陽離子多肽

基于多肽的遞送是一種較少被探索的系統(tǒng)，目前只有魚精蛋白（CureVac的狂犬疫苗）在臨床試驗中被評估。新的遞送方法包括使用陽離子細胞穿透肽（CPP）和陰離子肽。CPPs系統(tǒng)已被證明可以改善體內(nèi)T細胞免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，并在體外增強DC和人癌細胞中的蛋白質(zhì)表達。與陰離子肽偶聯(lián)的mRNA多鏈體在DC細胞中表現(xiàn)出細胞攝取的增加而不誘導(dǎo)細胞毒性。

圖9. 多肽遞送系統(tǒng)示意圖

鑒于mRNA的巨大應(yīng)用潛力，隨著越來越多關(guān)于mRNA納米遞送系統(tǒng)研究的開展，勢必會有更多轉(zhuǎn)染效率更強、毒性更低、穩(wěn)定性更好的新型遞送載體。

我司專注于提供品質(zhì)高核酸遞送輔料，關(guān)于LNP和Liposome的輔料均有品質(zhì)高現(xiàn)貨供應(yīng)。

核酸遞送路漫漫，一路都有AVT相伴。

Reference：

[1]. Li M, Li Y, Li S, Jia L, Wang H, Li M, Deng J, Zhu A, Ma L, Li W, Yu P, Zhu T. The nano delivery systems and applications of mRNA. Eur J Med Chem. 2022 Jan 5;227:113910. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113910. Epub 2021 Oct 8. PMID: 34689071; PMCID: PMC8497955.