摘要：近在SARS-CoV-2臨床試驗中mRNA疫苗的成功應(yīng)用一部分歸功于納米顆粒脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的開發(fā)，該系統(tǒng)不*在肌肉注射后有效表達mRNA編碼的免疫原，而且作為佐劑和疫苗反應(yīng)發(fā)揮作用。我們概述了mRNA遞送系統(tǒng)，并重點介紹了目前SARS-CoV-2疫苗臨床試驗中使用的納米顆粒脂質(zhì)體。這篇綜述文末分析了基因疫苗中納米顆粒脂質(zhì)體性能的決定因素。

簡介

由于COVID-19在全球的大流行，mRNA疫苗被推到了生物技術(shù)和制藥工業(yè)的中心舞臺。由BioNTech/輝瑞、Moderna、CureVac、Sanofi/TranslateBio、Arcturus/Duke-NUS新加坡醫(yī)學(xué)院、倫敦帝國理工學(xué)院、泰國朱拉隆功大學(xué)和Providence Therapeutics領(lǐng)導(dǎo)的mRNA疫苗人體試驗共有8個正在進行。

值得注意的是，其中兩項試驗已經(jīng)公布了3期臨床中期結(jié)果，報告了接種2次30 μg或100 μg劑量LNP包裹的編碼刺突蛋白免疫原的mRNA序列后，病毒感ran率降低94%以上。疫苗開發(fā)的速度也遠超出了預(yù)期，在SARS-CoV-2序列*公開后10個月就有了如此**的效果。這一成功不*證明了生物技術(shù)和制藥業(yè)有應(yīng)對緊急和緊缺的全球性需求的能力，也證明了mRNA作為一種藥物的所具有的能力，在中mRNA作為一種預(yù)防性疫苗。本綜述的目的是概述mRNA遞送系統(tǒng)的發(fā)展、總結(jié)SARS-CoV-2 mRNA疫苗的臨床前和臨床發(fā)現(xiàn)，并將其與其成功的遞送系統(tǒng)特征聯(lián)系起來。近有幾篇早于爆發(fā)的關(guān)于疫苗和zhi療mRNA遞送系統(tǒng)的的優(yōu)綜述已經(jīng)發(fā)表。

與小分子、DNA、寡核苷酸、病毒系統(tǒng)和蛋白質(zhì)，包括抗體等的其他藥物形式相比，mRNA療法具有許多優(yōu)勢和幾個難點。與寡核苷酸和大多數(shù)小分子藥物有限的靶點相比，mRNA可以調(diào)節(jié)刺激和抑制作用方式，也能夠表達或替換缺陷蛋白，這擴大了其使用的潛在適應(yīng)癥范圍。

與DNA相比，mRNA只需要獲得細胞質(zhì)的核糖體翻譯機制而不用進入細胞核，因此沒有整合到人體基因組的風(fēng)險。與蛋白質(zhì)和病毒系統(tǒng)相比，mRNA的制造是在細胞外快速制備的，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有天然的糖基化和構(gòu)象性質(zhì)。當與脂質(zhì)納米顆粒(LNP)遞送系統(tǒng)結(jié)合時，mRNA LNP的納米結(jié)構(gòu)特性也與病毒系統(tǒng)和循環(huán)的內(nèi)源性含脂質(zhì)乳糜微粒的大小、脂質(zhì)包膜和內(nèi)部基因組物質(zhì)等方面具有相似性，并且有助于其作為疫苗和其他zhi療藥物的遞送載體材料。

mRNA的難點在于其先天的免疫原性，對酶降解的敏感性以及細胞對裸露的mRNA攝取幾乎可以忽略不計。mRNA的先天免疫原性是由于toll樣受體(TLRs)、解旋酶受體(包括視黃酸誘導(dǎo)基因I (RIG-I)樣受體(RLRs)等)對單鏈和雙鏈RNA的識別，然后這些受體通過NF-κB和干擾素(IFN)調(diào)節(jié)因子IRF3和IRF7發(fā)出信號并轉(zhuǎn)位到細胞核，與I型IFN基因啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)I型IFN(IFN-α和IFN-β)的表達，并伴有促炎細胞因子產(chǎn)生，如**壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-12（IL-12）。分泌的干擾素作為一種病毒防御機制，通過其受體和同一細胞及相鄰細胞中的JAK/STAT途徑發(fā)出信號，**300多個受干擾素刺激的基因，包括蛋白激酶PKR。

雖然這種**可能有利于對mRNA疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但直接作用是通過eIF2a的PKR磷酸化來下調(diào)翻譯，這樣損害了eIF2的活性，抑制了mRNA翻譯，從而抑制了免疫原的蛋白質(zhì)合成。消除這種先天免疫反應(yīng)的主要方法是將天然存在的核苷如1-甲基二脲苷和核糖體RNA(通常不在mRNA中)中存在的其他核苷替換到mRNA序列中，這使得它不能被先天免疫傳感器檢測到。這種核苷修飾的免疫應(yīng)答mRNA是mRNA技術(shù)的基礎(chǔ)，該技術(shù)近在BioNTech/輝瑞和Moderna疫苗試驗中顯示了超過94%的有效性，這些技術(shù)是建立在對其他病原體試驗的基礎(chǔ)上，下文將詳細描述。

由于TLR7和TLR8主要識別富含GU的單鏈RNA序列，CureVac采用了第二種方法包括密碼子優(yōu)化和盡量不使用鳥苷酸。mRNAzhi療的第二個難點是其對核酸酶的敏感性，例如在它血清中的半衰期< 5分鐘。盡管siRNA的化學(xué)修飾在提高穩(wěn)定性和降低免疫原性方面非常成功，但迄今為止，由于翻譯機制對化學(xué)修飾的敏感性，使得它們在mRNA修飾并不成功。mRNA的第三個難點是大多數(shù)細胞類型（除不成熟的樹突細胞外）缺乏對裸露的mRNA的細胞攝取吸收。

后兩個難點可以通過將核苷修飾或mRNA導(dǎo)入適宜遞送系統(tǒng)來解決，這樣既保護mRNA免受核酸酶的攻擊，又促進細胞攝取。比如，當在動物模型中給藥時，與裸露的mRNA相比，加入納米顆粒脂質(zhì)體可保護mRNA免受核酸酶的攻擊，并增強細胞攝取和表達高達1000倍。

質(zhì)粒DNA主鏈通過體外轉(zhuǎn)錄(IVT)產(chǎn)生zhi療性mRNA，其帶有5’端的帽子結(jié)構(gòu)、5’端的非翻譯區(qū)(UTR)、編碼目的蛋白開放閱讀框、3’端UTR和polyA尾。天然真核生物的5’端帽子(cap0)是一種倒置的7-甲基鳥苷(m7G)，通過5’-5’三磷酸鹽與mRNA的**個核苷酸相連。

Cap0保護內(nèi)源性mRNA免受核酸酶攻擊，參與核輸出，與翻譯起始因子4結(jié)合，啟動蛋白質(zhì)翻譯。另外兩個5’端帽子結(jié)構(gòu)被證實(帽子1和帽子2)在第二個或第三個核糖核苷酸上含有額外的甲基，其免疫原性低于cap0(因此更佳)。目前常用的加帽方法包括共轉(zhuǎn)錄加帽，產(chǎn)生具有高翻譯和低免疫原性的帽子1。5’端UTR參與翻譯起始，包含一個Kozak序列以及一個非帽依賴翻譯的核糖體進入位點。開放閱讀框之后是3’端UTR，它影響mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達的持久性。polyA尾在大約100個殘基上編碼，有助于啟動翻譯和延緩降解。體外轉(zhuǎn)錄（IVT）生產(chǎn)的mRNA需要經(jīng)過純化，以去除具有免疫原性的DNA和雙鏈RNA污染物。

上述的mRNA可以是核苷修飾的，也可以是未經(jīng)核苷修飾的序列，但不能進行自我復(fù)制。能夠復(fù)制的自擴增mRNA (samRNA)也正在進行臨床試驗測試，其長度約為10 kb，由于它們有四個額外編碼的非結(jié)構(gòu)基因，包括一個RNA依賴的RNA聚合酶，導(dǎo)致了細胞內(nèi)的自復(fù)制，但由于缺乏結(jié)構(gòu)基因，不會產(chǎn)生感ran性粒子。

samRNA不能被核苷修飾，因為這些修飾會干擾自身擴增。在目前的臨床試驗中，由于samRNA的擴增過程，其通常使用較低的劑量(1-10 μg)，而非擴增的mRNA則需使用30-100 μg。表1總結(jié)了目前所有上述類別在進行人體臨床測試的mRNA疫苗。這些臨床試驗中的所有mRNA遞送系統(tǒng)都是納米顆粒脂質(zhì)體。

BioNTech/輝瑞LNP和Moderna LNP已經(jīng)公開其確切方，而其他一些公司尚未公開。其他產(chǎn)品很可能與Alnylam公司的 OnpattroTM產(chǎn)品相似(下文將進一步描述)，就像已經(jīng)公開的產(chǎn)品，可能都包含用的可電離脂質(zhì)。雖然所用的特定可電離脂質(zhì)可能未知，但其常用種類可以從期刊和**出版物中了解，如表1所示。

表1：目前在進行人體臨床測試采用納米顆粒脂質(zhì)包裹的mRNA疫苗總結(jié)如下。臨床試驗中的所有mRNA疫苗都使用納米顆粒脂質(zhì)體進行遞送。其類別和組成尚未公開，因此基于現(xiàn)有文獻和**，它們可能的類別如下所示。

在之前，mRNA疫苗用于傳染病的臨床前和臨床研究，包括流感、寨卡病毒、艾zi病毒、埃博拉病毒、狂犬病、基孔肯雅病毒、瘧疾、生殖器皰疹、弓形蟲等。這些研究被總結(jié)在近的一些綜述中。

COVID-19

SARS-CoV-2

LNP：脂質(zhì)納米顆粒

CNE:陽離子納米乳劑

NLC納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體

PBAE：聚β氨基酯

PACE：聚(胺-共-酯)

Epo

hPBAE：超支化聚β-氨基酯

PEI：聚乙烯亞胺

pABOL：二硫化物連接的聚酰胺基胺

SPLP：質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒

SNALP：核酸脂質(zhì)顆粒

IFN：干擾素

HAI：血凝抑制試驗

CVnCoV：CureVac mRNA LNP

mAbs：單克隆抗體

VHH:Vh結(jié)構(gòu)域

M2e:基質(zhì)蛋白2外域

Tfh：濾泡輔助T細胞

疫苗的早期遞送系統(tǒng)

魚精蛋白是一種富含精氨酸的陽離子蛋白的混合物，與mRNA形成絡(luò)合物。與裸露的mRNA相比，該絡(luò)合物提高了轉(zhuǎn)染效率。之后因為魚精蛋白絡(luò)合mRNA部分抑制蛋白質(zhì)表達，引入了游離mRNA和魚精蛋白絡(luò)合mRNA的混合物。動態(tài)光散射實驗表明，游離的mRNA的大小接近50nm，而魚精蛋白/mRNA絡(luò)合物的大小在250-350nm。

CureVac公司對狂犬病疫苗候選物CV7201就采用了這種方法，CV7201是一種凍干的、溫度穩(wěn)定的裸露的mRNA，由編碼狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的游離和魚精蛋白絡(luò)合mRNA組成。在Balb/c小鼠中，兩次給予10 μg及以上的誘導(dǎo)的中和效價大于世界衛(wèi)生組織的保護閾值，并且兩次給予80 μg的劑量對大腦有保護作用。在一項通過皮下和肌內(nèi)途徑的注射80–640 μg劑量的1期人體試驗中，*一個小組使用特定的注射裝置接受了三次80–400 μg劑量，達到了世衛(wèi)組織中和效價閾值。

其中101名參與者中有一名在高劑量下產(chǎn)生了嚴重的不良反應(yīng)(貝爾麻痹)，同時有5%的參與者也產(chǎn)生嚴重不良反應(yīng)。不良反應(yīng)的總體發(fā)生率很高，其中有97%在注射部位產(chǎn)生不良反應(yīng)，有78%產(chǎn)生全身不良反應(yīng)。由于魚精蛋白絡(luò)合mRNA的給藥效果并不理想，CureVac公司采用了來自Acuitas的納米顆粒脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，并證明在Balb/c小鼠中以0.5 μg的低劑量 (與魚精蛋白絡(luò)合mRNA的10 μg相比)和非人的靈長類動物中以10 μg的劑量給藥極大提高了中和效價。T細胞反應(yīng)的**以及引流淋巴結(jié)和注射部位中的白細胞介素-6（IL-6）和**壞死因子（TNF）表明了LNP在介導(dǎo)陽性免疫反應(yīng)中的作用。目前已經(jīng)啟動了一項臨床試驗(NCT03713086)，預(yù)計2021年將報道中期結(jié)果。

通過將陽離子脂質(zhì)DOTAP與含有角鯊烯、山梨醇三油酸酯和聚山梨酯80的商業(yè)佐劑(MF59)在pH 6.5的檸檬酸鹽緩沖液中混合，開發(fā)了用于mRNA遞送的陽離子納米乳劑(CNE)。將編碼呼吸道合胞病毒糖蛋白(RSV-f)的自擴增mRNA和來自DOTAP的NP胺聯(lián)合應(yīng)用，后者與mRNA中磷酸鹽的比例為7，生成了大小為129 nm的納米顆粒。

采用這種方法的一個優(yōu)點是能夠分別存儲CNE和mRNA，并且*在使用時將它們結(jié)合起來。在Balb/c小鼠中兩次給藥15 μg的中和效價高于亞單位佐劑疫苗的效價。在非人類靈長類動物中兩次給藥75 μg就可以達到可檢測到的中和效價和T細胞反應(yīng)?；谶@一概念，一個**的團隊創(chuàng)造了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)，它是CNE和脂質(zhì)納米顆粒的混合物，由液態(tài)油相(如角鯊烯)和飽和甘油三酯的固相脂質(zhì)組成。NLCs含有編碼sika梅花鹿免疫原的自擴增mRNA，其大小為40 nm，NP比為15，并且在單次注射低至0.1 μg或0.01 μg的劑量后能夠在C57BL/6小鼠中產(chǎn)生保護性中和效價。

用于mRNA遞送的聚合物

幾十年來，陽離子聚合物已廣用于核酸遞送，例如包括聚賴氨酸、聚乙烯亞胺（PEI）、DEAE-葡聚糖、聚β氨基酯(PBAE)和殼聚糖。*簡單方式即把過量陽離子聚合物與核酸混合，形成靜電結(jié)合的陽離子多聚體。

盡管已經(jīng)開發(fā)了許多聚合物，但它們不如用于核酸遞送的脂質(zhì)納米粒先進，并且能將它們成功應(yīng)用于的動物研究的疫苗有限。PBAE與PEG脂質(zhì)混合，形成mRNA/PBAE/PEG納米顆粒脂質(zhì)體，能夠在小鼠靜脈注射后將mRNA遞送至肺部。在靜脈注射基因遞送**后使用*******作為考察報告，一種可生物降解的聚合物，聚胺共酯(PACE)三元共聚物在mRNA遞送中已經(jīng)被驗證。通過控制分子量和端基化學(xué)，PACE家族的一個10 kDa的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了與TransIT相同的體外轉(zhuǎn)染效率，TransIT是一種有效但有毒的、膠體不穩(wěn)定的且大體積商業(yè)產(chǎn)品。*******在靜脈注射20 μg時的體內(nèi)表達效果是TransIT的5倍。

合成了超支化聚β-氨基酯（hPBAE）用于通過吸入將mRNA遞送至肺。hPBAE mRNA復(fù)合物的大小為137 nm，在小鼠中霧化時能夠轉(zhuǎn)染25%的肺內(nèi)皮細胞，吸入沒有明顯的毒性，表達水平是分支化PEI的10倍。合成了分子量在8 kDa至167 kDa之間的二硫化物連接的聚酰胺基胺（pABOL），它能夠形成大小接近100 nm的多分散納米復(fù)合物。

這些使用自擴增mRNA復(fù)合物的體內(nèi)熒光霉素的表達結(jié)果與肌肉注射PEI相似。當對小鼠以增強免疫策略進行血凝素(HA)流感免疫原給藥時，低分子量8 kDa的pABOL中和效價高，超過PEI。8 kDa的pABOL能釋放1μg HA的自擴增mRNA，也能部分抵御致命的流感，防止死亡，但不能防止體重**下降。倫敦帝國理工學(xué)院的研究組認為，這種pABOL系統(tǒng)可以為SARS-CoV-2提供一種自擴增的mRNA免疫原，但使用pABOL給藥SARS-CoV-2免疫原的效果比使用Acuitas優(yōu)化的納米顆粒脂質(zhì)體給藥的效果低1000倍。

總的來說，1μg pABOL中自擴增RNA產(chǎn)生的結(jié)合抗體和中和效價與0.001μg優(yōu)化的脂質(zhì)納米顆粒相同(Dr. Anna Blakney)。許多其他聚合物系統(tǒng)能夠在體外或體內(nèi)遞送mRNA，但仍需對疫苗進行測試。

研究進展

當前中SARS-CoV-2納米顆粒脂質(zhì)體的研究進展

*早的mRNA轉(zhuǎn)染試劑是季銨化陽離子DOTAP結(jié)合可電離和促細胞融合的DOPE，從DNA轉(zhuǎn)染得到，用于多種細胞類型中的mRNA轉(zhuǎn)染。雖然在體外有效，但**性的陽離子季銨基團使這些大體積的脂質(zhì)體迅速從體循環(huán)和靶向**肺中被**，并表現(xiàn)出毒性。

目前的LNP的前體是穩(wěn)定的質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒(SPLP)，它是通過結(jié)合促細胞融合的可電離的DOPE和季銨化的陽離子脂質(zhì)DODAC而形成的，通過靜電作用包裹質(zhì)粒DNA，然后再用親水的PEG包被脂質(zhì)體，使其在水溶液中穩(wěn)定，并在體內(nèi)給藥時限制蛋白質(zhì)和細胞的相互作用。

遞送機制*關(guān)鍵的一步是：細胞內(nèi)吞后，DOPE在內(nèi)涵體內(nèi)被質(zhì)子化，并且由于DOPE的錐形結(jié)構(gòu)，可以與內(nèi)涵體磷脂形成一個內(nèi)涵體溶解離子對，以促進內(nèi)涵體釋放。SPLP后來進一步發(fā)展為含有siRNA的穩(wěn)定化核酸脂質(zhì)顆粒(SNALP)，包括四種脂質(zhì):可離子化而非季銨化的陽離子脂質(zhì)、形成季銨化兩性離子的飽和雙層脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和PEG-脂質(zhì)。除了與核酸靜電結(jié)合之外，SNALPs中的可電離脂質(zhì)起到融合脂質(zhì)的作用，并在內(nèi)涵體中質(zhì)子化，與內(nèi)涵體磷脂形成膜不穩(wěn)定離子對。目前已知DSPC有助于在PEG表面下形成穩(wěn)定的雙分子層。膽固醇起著多種作用，包括填充顆粒間隙、限制LNP-蛋白質(zhì)相互作用以及可能促進膜融合?？呻婋x的脂質(zhì)的**作用是在生理酸堿度下保持中性，從而消除循環(huán)中的陽離子電荷，但在pH為6.5時在內(nèi)涵體中被質(zhì)子化，促進內(nèi)涵體逃逸。

2018年獲得臨床批準的**siRNA產(chǎn)品的開發(fā)主要集中在優(yōu)化可電離脂質(zhì)，其次是PEG-脂質(zhì)和LNP中四種脂質(zhì)的比例，以及LNP組裝和制備過程。根據(jù)分子形狀假說，發(fā)現(xiàn)C18尾中不飽和鍵的**數(shù)目是提供一個通過醚類與二甲胺頭部相連的二油酸尾部。

然而，將單一的連接體引入二油酸尾部，從二甲胺頭部到連接體的碳數(shù)經(jīng)過優(yōu)化，導(dǎo)致LNP可電離脂質(zhì)的pKa值接近可電離脂質(zhì)DLin-MC3-DMA的6.4。優(yōu)化的佳一步是將MC3/DSPC/膽固醇/PEG-脂質(zhì)的這些脂質(zhì)的摩爾比調(diào)整為50/10/38.5/1.5。

總體來說，從DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的這一優(yōu)化過程需要在數(shù)千種**中篩選300多種可電離脂質(zhì)，并導(dǎo)致效果增加200倍以及有效劑量相應(yīng)減少，以實現(xiàn)對> 80%的靶基因和**窗的長久抑制，OnpattroTM在2018年獲得臨床批準。為siRNA開發(fā)的這種MC3制劑是下文所述的LNP后續(xù)開發(fā)的基礎(chǔ)(圖1)。這些LNP在被批準用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗后，正處于緊急使用。

圖1：mRNA納米顆粒脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。使用冷凍電子顯微鏡、小角中子散射和小角x光散射表明，mRNA脂質(zhì)納米顆粒包括低拷貝數(shù)的mRNA(1–10)，并且mRNA在LNP中心與可電離脂質(zhì)結(jié)合。PEG脂質(zhì)與DSPC一起形成LNP的雙層表面。膽固醇和可電離的脂質(zhì)以帶電和不帶電的形式分布在整個LNP。可在*近的綜述中獲得其他遞送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

為了遞送核苷修飾的mRNA編碼的免疫原，Moderna使用上述Onpattro制劑中的MC3進行了幾項臨床前和臨床研究。通過在這些研究中將一類新的可電離脂質(zhì)與MC3進行了比較，證實了MC3是可電離脂質(zhì)。這一新種類包括脂質(zhì)H，它是Moderna公司的SARS-CoV-2產(chǎn)品mRNA-1273(表2)中可電離的脂質(zhì)SM-102。

使用核苷修飾的mRNA編碼寨卡病毒免疫原，MC3 LNP能夠保護缺乏ⅰ型和ⅱ型干擾素(IFN)信號的免疫低下小鼠，在免疫增強策略中使用一次10 μg劑量或兩次2 μg劑量將抑制小鼠的死亡。在免疫功能正常的小鼠中，預(yù)先用抗ifnar1阻斷抗體遞送來建立一個致死模型，也得到了相似的結(jié)果。在一系列核苷修飾mRNA編碼血凝素(HA)免疫原遞送的流感研究中，皮下給藥的MC3 LNP能夠以低至0.4 μg的單劑量充分保護小鼠免受死亡，即使使用單劑量高達10 μg體重也還是減輕。

單劑量50 μg或100 μg在雪貂中產(chǎn)生高HAI(血凝抑制試驗)效價，在非人的靈長類動物中兩次給藥200或400 μg也是如此。在被給藥100 μg的一小部分(23名)受試者中，所有受試者的HAI效價> 40(世衛(wèi)組織相關(guān)的保護指標)，比研究開始時的基線高出4倍以上。在一個更大的I期試驗中，使用相同的MC3 LNPs遞送兩種不同的核苷修飾的mRNA編碼的HA免疫原，肌肉注射100μg H10N8免疫原導(dǎo)致所有23名受試者的HAI效價> 40。

盡管沒有發(fā)生危及生命的不良反應(yīng)，但這23名受試者中有3人產(chǎn)生了嚴重的3級不良反應(yīng)。在三名受試者中有兩名出現(xiàn)可以暫停試驗的3級不良反應(yīng)后，停止了預(yù)計的400 μg給藥量。在較低劑量下，盡管幾乎每個受試者都產(chǎn)生至少一次不良反應(yīng)，但不良反應(yīng)的頻率和嚴重程度降低。這些研究是有前途的，也強調(diào)了相對狹窄的**窗，以不引起不良反應(yīng)的劑量下獲得保護性免疫。這讓人想起MC3前體DLin-DMA狹窄的**窗，需要提高效價以降低劑量，但仍然能實現(xiàn)有效的基因敲除。

表2：納米顆粒脂質(zhì)體中使用的可電離脂質(zhì)。納米顆粒脂質(zhì)體中使用的可電離脂質(zhì)的一個關(guān)鍵特征是，通過TNS染料結(jié)合試驗測量的LNP可電離脂質(zhì)的pKa值應(yīng)在6–7的范圍內(nèi)。大多數(shù)可電離基團的理論計算pKa值在8-9.5的范圍內(nèi)，如下所示的氮原子在水介質(zhì)中，使用商業(yè)軟件從理論上估計這些值。pKa值從理論值到TNS值下降了2-3個點，這是由于脂質(zhì)相中質(zhì)子溶劑化的能量高得多，導(dǎo)致在TNS分析過程中測量的脂質(zhì)中的pH比水相的pH增加了2-3個點。

由于siRNA產(chǎn)品需要對慢性疾病重復(fù)給藥，因此人們擔心MC3中二醇烷基尾的緩慢降解會導(dǎo)致重復(fù)給藥的累積和潛在毒性。MC3的生物可降解變體，脂質(zhì)319(表2)，是通過用一種在體內(nèi)容易被酯酶降解的伯酯取代烷基鏈中的兩個雙鍵之一而產(chǎn)生的。脂質(zhì)319在肝臟中的半衰期不到一小時，但它在肝臟中保持的基因沉默效率與MC3相似。

在體內(nèi)的降解產(chǎn)物及其分泌和脂質(zhì)319的無毒性質(zhì)得到了證實。在SARS-CoV-2的臨床前和臨床研究中采用脂質(zhì)319的這一研究為代，在BioNTech和CureVac產(chǎn)品中使用Acuitas LNP，盡管在倫敦帝國理工學(xué)院試驗中自擴增RNA的Acuitas LNP給藥被用于*近的專利申請中，以來自Acuitas的脂質(zhì)A9代(參考表2)。*近，BioNTech批準的BNT162b2中的Acuitas可電離脂質(zhì)是ALC-0315(表2)。這些LNP的一個重要特點是，它們是通過在靜脈注射后篩選肝臟中的mRNA表達而開發(fā)的，可能還沒有完全優(yōu)化用于肌內(nèi)注射mRNA的疫苗。

Moderna*近開發(fā)了一類新的可電離脂質(zhì)來替代MC3，主要是由于上MC3緩慢降解，通過使其具有比二醇MC3烷基尾更大的分支來提高其效價。這種新型脂質(zhì)有一個乙醇胺可電離的頭部，連接到一個含有一級可降解酯的飽和尾部(如Maier 2013)和第二個飽和尾部，第二個飽和尾部在七個碳后使用一個不太可降解的二級酯分支成兩個飽和C8尾部，如脂質(zhì)5 (表2)，其針對靜脈注射到肝臟進行了優(yōu)化，還發(fā)現(xiàn)一個類似的脂質(zhì)H或SM-102，*適合進行肌肉注射疫苗。

Acuitas研發(fā)脂質(zhì)的的一個特征是增加分支，脂質(zhì)A9總共有五條支鏈 (表2)，而Moderna LNP中SM-102有三條分支。增加的分支產(chǎn)生了一種具有更類似圓錐形結(jié)構(gòu)的可電離脂質(zhì)，因此，當陽離子脂質(zhì)與內(nèi)涵體中的陰離子磷脂配對時，將出現(xiàn)更大的膜破壞能力，符合幾十年前的分子形狀假說。

當靜脈注射時，24小時內(nèi)肝臟中未檢測到脂質(zhì)5，而MC3在肝臟中的初始劑量為71%，這驗證了脂質(zhì)5的降解性。靜脈注射后，脂質(zhì)5在小鼠體內(nèi)的熒光素酶表達比MC3強3倍，在非人的靈長類動物體內(nèi)的hEPO表達比MC3強5倍。效價的這些增加與內(nèi)涵體釋放的增加一致，并且推測可能是由內(nèi)涵體釋放的增加引起的，對于脂質(zhì)5，細胞中多達15%的mRNA從內(nèi)涵體中釋放，而對于MC3，這一比例為2.5%，后者與之前使用siRNA測量的MC3相似。

然而，在這些內(nèi)涵體釋放實驗中，MC3的細胞攝取率比脂質(zhì)5的高四倍，因此這兩種LNP在細胞質(zhì)中釋放的mRNA的**量是相似的。在肌肉注射疫苗時進行了同樣的可電離脂質(zhì)庫研究，同樣發(fā)現(xiàn)其可降解，并由于一級酯而迅速消除，并且與MC3相比，在蛋白質(zhì)表達或免疫原性方面，小鼠中流感核苷修飾的mRNA編碼免疫原的效果增加了3-6倍，盡管在非人的靈長類動物中的免疫原性與5 μg增強免疫劑量的MC3相同。

脂質(zhì)H或SM-102(表2)被確定為**候選物，并且在結(jié)構(gòu)上*與脂質(zhì)5不同。脂質(zhì)5通過伯酯的兩個碳置換，是靜脈給藥的**藥物。脂質(zhì)5 LNP的pKa值為6.56，而脂質(zhì)H LNP的值為6.68，這表明pKa值的輕微增加可能有利于肌肉注射和靜脈注射給藥，盡管這種差異在檢測的可變性范圍內(nèi)。對大鼠肌肉注射部位的組織學(xué)檢查表明，與MC3相比，脂質(zhì)H LNPs吸引的富含中性粒細胞和巨噬細胞的炎癥浸潤較少，這可能會降低人體試驗中注射部位的反應(yīng)原性。

脂質(zhì)納米顆粒在當前SARS-CoV-2臨床試驗中的應(yīng)用

1 BioNTech/輝瑞

BioNTech在SARS-COV-2試驗的遞送系統(tǒng)脂質(zhì)成分主要是Acuitas的ALC-0315(表2)、DSPC、膽固醇和PEG-脂質(zhì)。CureVac和倫敦帝國理工學(xué)院可能也使用ALC-0315或A9(表2)。BioNTech開始用四種mRNA編碼的免疫原開發(fā)SARS-CoV-2疫苗，其中兩種是核苷修飾的，一種是未修飾的，一種是自擴增的。

其中有關(guān)兩種核苷修飾的mRNA:BNT162b1是一種較短的、約1 kb的序列，其編碼刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由折疊三聚結(jié)構(gòu)域修飾，通過多價顯示增加其免疫原性；

另一種BNT162b2是較長的、約4.3 kb的薛烈，其編碼二脯氨酸穩(wěn)定的全長的膜結(jié)合刺突蛋白。BNT162b2最近獲得了歐盟和美國的緊急批準。在一項臨床前研究中，單次給藥0.2、1和5μg的BNT162b2后，可檢測到小鼠體內(nèi)的結(jié)合抗體和中和效價，從**劑量到**劑量增加一個數(shù)量級，并在Th2細胞因子水平非常低的CD4+和CD8+脾細胞中引起強烈的抗原特異性Th1 IFNγ和IL-2反應(yīng)。引流淋巴結(jié)也含有大量生發(fā)中心B細胞和CD4+和CD8+ T濾泡輔助細胞(Tfh)的數(shù)量也升高，這些細胞以前被認為是由mRNA LNP疫苗中LNP單獨誘導(dǎo)。

在非人的靈長類動物中，30 μg或100 μg的免疫增強劑量引起的結(jié)合抗體和中和效價是人類恢復(fù)期組的10倍以上，并產(chǎn)生強烈的Th1偏向性T細胞反應(yīng)，這對預(yù)防疫苗相關(guān)的增強型呼吸道疾病很重要。在6只的獼猴中，兩次給藥100 μg后在支氣管肺泡灌洗液和鼻拭子中檢測不到病毒效價。對較小的mRNA編碼免疫原BNT162b1的1期臨床試驗中計劃在第1天和第21天給藥10、30和100 μg。中等劑量30 μg誘導(dǎo)的抗體結(jié)合和中和效價分別比人類恢復(fù)期組高30倍和3倍。由于第一次給藥后出現(xiàn)嚴重的注射部位疼痛，因此未給予100 μg劑量的增強劑量。給藥30 μg的增強劑量后100%的受試者產(chǎn)生輕度或中度的注射部位疼痛。第二次接種30 μg劑量后，幾乎所有受試者都經(jīng)產(chǎn)生了輕度或中度的全身不良反應(yīng)，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)或疲勞。該試驗還證明了來自外周血單核細胞有強Th1偏向性T細胞反應(yīng)。

一項2期臨床試驗比較了年輕(18-55歲)和年長(65-85歲)受試者組接種 BNT162b1和BNT162b2后的一些指標。老年組的結(jié)合和中和抗體效價略低，但仍高于恢復(fù)期組的受試者。與年輕組相比，老年組的不良反應(yīng)嚴重程度也降低了。BNT162b2與BNT162b1相比，全身不良反應(yīng)(發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞)的發(fā)生率**降低了約兩倍。正是BNT162b2耐受性的增加推動了其3期臨床試驗，最近該試驗宣布有效率達到94%，因為安慰劑組出現(xiàn)了162例COVID-19感ran，而接受兩次30 μg劑量BNT162b2的接種組*發(fā)現(xiàn)8例感ran。

2 Moderna

在Moderna的研究中，核苷修飾的mRNA編碼的免疫原是一種跨膜錨定的二脯氨酸穩(wěn)定的預(yù)融合刺突，具有天然的呋喃裂解位點，并以LNP遞送，該LNP參照MC3 LNP原型，但用脂質(zhì)H (SM-102)替代MC3。mRNA LNP (mRNA-1273)接種劑量為1 μg而非0.1 μg，小鼠接種第1天和第21天，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。T細胞反應(yīng)似乎是一種Th1/Th2平衡的反應(yīng)，在小鼠的病毒模型中，兩次給藥1 μg（非0.1 μg）后，小鼠肺部和鼻甲的病毒效價降低到基線。以獼猴為實驗對象，兩次給藥劑量為100 μg，給藥后能產(chǎn)生高結(jié)合和中和效價以及在外周血中產(chǎn)生Th1偏向反應(yīng)，同時也有強Tfh反應(yīng)。兩次給藥10 μg劑量后效價和T細胞反應(yīng)**降低。

同樣，100 μg劑量能夠?qū)⒅夤芊闻莨嘞匆汉捅鞘米又械牟《拘r降低到基線水平，而10 μg劑量*在肺部有效。在一項1期臨床研究中，每組15名患者，給藥頻率為間隔4周2次，給藥劑量為25、100或250 μg，100 μg劑量的結(jié)合和中和效價比恢復(fù)期高約10倍，相當于25 μg的恢復(fù)期。所有受試者在100 μg和250 μg劑量下均產(chǎn)生了不良反應(yīng)，250 μg組的14名受試者中有3名發(fā)生了嚴重的不良反應(yīng)，并被停藥。在隨后對老年患者(56-71歲和71歲以上)進行的1期臨床研究中，發(fā)現(xiàn)25 μg和100 μg劑量產(chǎn)生的結(jié)合抗體效價高于恢復(fù)期血漿中的，而中和效價與100 μg相當，但低于恢復(fù)期的25 μg。

即使是在老年組也有約80%的患者在第二次接種疫苗后仍出現(xiàn)不良反應(yīng)。外周血分析顯示CD4 T細胞反應(yīng)是Th1偏向型的。與25 μg劑量相比，100 μg劑量的中和效價更高，因此進一步進行了3期臨床試驗，中期結(jié)果顯示，安慰劑組出現(xiàn)了90例COVID-19感ran，而接種疫苗組只有5例感ran，防護有效率達到94.5%。一**委員會對Moderna的3期臨床試驗的中期分析結(jié)果表明，出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)包括：9.7%的接種者出現(xiàn)疲勞、8.9%的接種者出現(xiàn)肌肉疼痛、5.2%的接種者出現(xiàn)關(guān)節(jié)tong、4.5%的接種者出現(xiàn)**，而在輝瑞/BioNTech的3期臨床試驗中，出現(xiàn)疲勞的頻率較低，只有3.8%，**為2%。

3 CureVac

CureVac mRNA LNP (CVnCoV)采用的是一種非化學(xué)修飾的、序列工程mRNA，它編碼一種二脯氨酸穩(wěn)定的全長的S蛋白，采用Acuitas LNP遞送技術(shù)，可能使用可電離脂質(zhì)ALC-0315。小鼠實驗中劑量為2 μg時，對兩次給藥之間的周數(shù)（從1到4不等）進行了研究，發(fā)現(xiàn)較長的時間間隔在Balb/c小鼠中產(chǎn)生更高的效價和T細胞反應(yīng)以及平衡的Th1/Th2反應(yīng)。產(chǎn)生中和抗體需要第二次給藥，兩次給藥0.25 μg不足以產(chǎn)生中和抗體。在敘利亞金黃地鼠實驗中，兩次給藥10 μg (非2 μg)能夠?qū)⒎?非鼻甲)中的病毒效價降低到基線。在劑量為2-12 μg的1期臨床試驗中，*在**劑量12 μg時發(fā)現(xiàn)中和效價達到恢復(fù)期血清水平，這使得較高劑量（16和20 μg）被納入正在進行的2期臨床試驗。所有給藥劑量為12 μg的患者在每次給藥后都產(chǎn)生了全身不良反應(yīng)，大多數(shù)為中度和重度，而> 80%的患者在局部注射部位產(chǎn)生了輕度和中度疼痛。

4 TranslateBio

Translate Bio使用的是一種非修飾的mRNA，其編碼雙突變的二脯氨酸穩(wěn)定的刺突蛋白，采用LNP技術(shù)平臺，使用可電離脂質(zhì)C12-200，C12-200很可能是近期的基于ICE-或半胱氨酸的可電離脂質(zhì)家族合成的候選物。在Balb/c小鼠實驗中，發(fā)現(xiàn)在0.2-10 μg范圍內(nèi)兩次給藥使結(jié)合和中和效價遠高于恢復(fù)期水平。在非人的靈長類動物實驗中，15、45和135 μg劑量均產(chǎn)生超過人類恢復(fù)期的效價，并且其免疫反應(yīng)也是Th1偏向型的。

5 Arcturus

Arcturus使用的是一種自擴增的、全長的、未修飾的mRNA，其編碼融合前SARS-CoV-2全長的刺突蛋白，該LNP中使用帶有硫酯的可電離脂質(zhì)，通過兩個額外的酯基將含胺的頭部和脂質(zhì)尾部相連接。這個脂質(zhì)家族中兩種可能的可電離脂質(zhì)是脂質(zhì)10a(在[111]的表4中)或脂質(zhì)2，2 (8，8) 4CCH3(在[57]的第33頁上)(表2)。

后者有三個分支，類似于Moderna脂質(zhì)H，但有一個可降解的硫酯連接到頭部。自擴增mRNA的一個特征是熒光素酶基因的表達在肌肉注射給藥一周后保持在相當恒定的水平，而常規(guī)mRNA的表達則迅速下降。在C57BL/6小鼠中，單獨接種疫苗使體重減輕和臨床評分增加。在具有高水平抗原特異性T細胞反應(yīng)的Th1偏向反應(yīng)中，只需要對小鼠以2 μg或10 μg(非0.2 μg)的劑量單次給藥，就可以使中和效價達到100以上。在K18-hACE2小鼠致死模型中，單次給藥2 μg或10 μg也可以100%保護小鼠，并且小鼠體重沒有減輕，且肺和腦的病毒效價降低到基線。Arcturus已經(jīng)完成了接種劑量為1-10 μg的1期臨床試驗，并選擇使用7.5 μg作為接種劑量進行3期臨床試驗。

6倫敦帝國理工學(xué)院

倫敦帝國理工學(xué)院使用了一種由Acuitas LNP技術(shù)遞送的、自擴增的編碼預(yù)融合的穩(wěn)定的刺突蛋白的mRNA，該蛋白在由脂質(zhì)A9的**中有所描述(表2)。在Balb/c小鼠中兩次注射0.01 μg至10 μg的劑量后，產(chǎn)生了非常高的劑量依賴性抗體和中和效價。該反應(yīng)是強Th1偏向型，與較低的0.1和0.01 μg劑量相比，10和1 μg的劑量產(chǎn)生了高三倍的抗原特異性脾細胞反應(yīng)。該疫苗即將開始1期臨床試驗。

7 朱拉隆功大學(xué)，賓夕法尼亞大學(xué)

朱拉隆功大學(xué)與賓夕法尼亞大學(xué)合作，使用Genevant LNP技術(shù)開發(fā)一種天然刺突免疫原核苷修飾的mRNA LNP，采用的脂質(zhì)可能是CL1。他們的目標是于2021年第一季度開始第一階段臨床試驗，并于2021年第四季度開始向泰國和七個周邊中低收入國家供應(yīng)疫苗。

8 Providence Therapeutics

Providence Therapeutics獲得了加拿大衛(wèi)生部的授權(quán)通知，可以對PTX-COVID-19B mRNA LNP疫苗進行人體臨床試驗。對編碼受體結(jié)合域（具有或不具有呋喃裂解位點突變的全長刺突蛋白）的三種候選mRNA進行臨床前研究，按照免疫增強方法以C57BL6小鼠為實驗對象以20 μg的劑量給藥。

該疫苗使用來自Genevant的未公開脂質(zhì)（可能與表2中的CL1相似）的臨床前數(shù)據(jù)，顯示出全長的和呋喃突變的有效載荷具有強大的中和效價。第一階段臨床試驗計劃于2021年第一季度開始，同時疫苗的生產(chǎn)和銷售計劃于同年獲得監(jiān)管機構(gòu)的批準。

9 儲存和供應(yīng)

實驗室制造的大多數(shù)RNA LNP可以在4℃下保存幾天，但隨后出現(xiàn)顆粒尺寸增加和生物活性逐漸喪失（如熒光素酶表達）的特點。在以前的siRNA LNP方中，通常由于LNP聚集導(dǎo)致尺寸隨著時間增大。為了mRNA LNP疫苗能穩(wěn)定的儲存和供應(yīng)，需要采用冷凍形式。Moderna的COVID-19疫苗需要在-25℃至-15℃之間儲存，在2℃至8℃之間可穩(wěn)定儲存30天，在8℃至25℃可穩(wěn)定儲存12小時。

輝瑞/BioNTech的COVID-19疫苗需要在-80℃至-60℃之間儲存，解凍之后在2℃至8℃之間儲存最多5天，然后在注射前用鹽水稀釋。在儲存和運輸過程中，輝瑞疫苗所需的極低溫度比Moderna疫苗所需的常規(guī)冷凍溫度更難達到。這些溫度差異背后的原因并不明顯，因為兩種疫苗都含有類似的高濃度蔗糖作為冷凍保護劑。Moderna的mRNA LNPs被冷凍在Tris和醋酸鹽兩種緩沖液中，而輝瑞/BioNTech疫苗*使用磷酸鹽緩沖液。眾所周知，磷酸鹽緩沖液不適合冷凍，因為它們?nèi)菀壮恋矶医Y(jié)晶會引起pH突變。凍干工藝對mRNA LNPs來說是一個技術(shù)難點。然而，Arcturus已經(jīng)聲明，他們的COVID-19 mRNA疫苗在凍干形式中是穩(wěn)定的，盡管這種凍干制劑的溫度穩(wěn)定性尚未公開，但這可能會**簡化供應(yīng)。

脂質(zhì)納米顆粒

許多脂質(zhì)樣實體，稱為脂質(zhì)類化合物類脂，最初是為siRNA遞送而開發(fā)的，隨后用于mRNA遞送。C12-200就是一個例子(表2)，由于其通過靜脈給藥在肝細胞基因沉默中的高效性，而在類脂家族中脫穎而出。為了實現(xiàn)高效的肝臟靶向基因沉默，C12-200與MC3 Onpattro原型相同的脂質(zhì)相結(jié)合，即50%可電離脂質(zhì)、10% DSPC、38.5%膽固醇和1.5% PEG-脂質(zhì)。

后來的一項研究發(fā)現(xiàn)，通過將可電離脂質(zhì)的百分比降低到35%，同時將可電離脂質(zhì)與核酸的重量比從5增加到10，并用促細胞融合的不飽和DOPE取代DSPC，可以將C12-200對同一肝臟靶點的mRNA遞送效率提高7倍。

有趣的是，這種優(yōu)化的方將mRNA表達提高了7倍，但沒有改變siRNA的沉默效率。在這種方中，C12-200也被研究用于小鼠和非人靈長類動物的mRNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)替代療法，但是當皮下注射時，通過組織學(xué)觀察，它會產(chǎn)生強烈的炎癥反應(yīng)。C12-200是一種小分子樹狀聚合物，具有五個烷基鏈和五個氮原子，根據(jù)ACDLabs Percepta等商用軟件進行電離分析，發(fā)現(xiàn)其中三個似乎是可質(zhì)子化的(表2)。另一種樹枝狀大分子脂質(zhì)，5A2-SC8，在觀察過程中發(fā)現(xiàn)對肝臟具有高siRNA傳遞效率，并且還具有五個氮原子和五個短烷基鏈(表2)。

類脂5A2-SC8對于mRNA遞送的效率很低，除非通過將可電離的脂質(zhì)摩爾分數(shù)降低到24%，使用DOPE代替DSPC，并增加其他脂質(zhì)比例來改變其方參數(shù)，但是同時5A2-SC8與mRNA的重量比將增加到20。

這些方的改變似乎是這些樹枝狀大分子型類脂成為有效的mRNA遞送載體所必需的，這可能是因為它們具有多質(zhì)子的頭部和樹枝狀大分子結(jié)構(gòu)。另一種非常高分子量的修飾樹枝狀大分子被用于遞送編碼流感、埃博拉和弓形蟲免疫原的自擴增mRNA，并且在小鼠實驗中，在單次給藥40 μg的高劑量或免疫增強方法注射4 μg后(這對復(fù)制RNA也是高劑量)，發(fā)現(xiàn)可以避免三種病原體的感ran。最近對類脂進行研究發(fā)現(xiàn)，與其他類脂相比，這種小的三氮樹枝狀大分子的四個烷基鏈末端增加一個碳支鏈，肝臟表達能力提高了10倍以上。

這種效價的增加與LNP的pKa值沒有相關(guān)性，但與pH為 5時TNS染料的**熒光有相關(guān)性，這表明內(nèi)涵體質(zhì)子化的幅度與mRNA表達相關(guān)，推測可能是促進內(nèi)涵體逃逸。根據(jù)分子形狀假說，增加的碳支鏈也可以產(chǎn)生一個更錐形的結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生更多的膜破裂。

編碼抗體基因的mRNA LNP的遞送

目前市場上有70多種單克隆抗體（mAbs），全球銷售額為1250億美元。使用mRNA編碼的抗體具有以下優(yōu)勢，包括有益于天然翻譯后修飾的內(nèi)源性蛋白質(zhì)合成，以及是一種不需要細胞培養(yǎng)和對蛋白質(zhì)產(chǎn)品大量純化和表征的簡化生產(chǎn)方法。通過將編碼VRC01（一種針對HIV-1的中和抗體）輕鏈和重鏈的純化核苷修飾的mRNA包封到Acuitas LNPs中，顯示出遞送mRNA編碼的mAbs可能用于被動免疫。

以 Balb/c小鼠為實驗對象，靜脈注射30 μg mRNA LNP（靶向肝細胞），表達mAbs超過一周，血清水平達到150 μg/ml，高于直接注射600 μg mAbs，每周注射能夠保持血清水平在40 μg/ml以上。CD34-NSG人源化小鼠注射30 μg和15 μg的mRNA LNP可以抵御24小時后的HIV-1攻擊，入侵2周后的血清病毒RNA復(fù)制分析也證明這一觀點。

CureVac的一項研究證實了**性非修飾mRNA編碼抗體的可行性，該研究也使用了Acuitas LNPs，其中選擇了對多種狂犬病毒株具有**中和能力的IgG mAbs，以及針對肉毒桿菌**的純重鏈Vh結(jié)構(gòu)域(VHH)中和劑。還生產(chǎn)了一種靶向CD20的、mRNA編碼的利妥昔單抗，其中CD20是非霍奇金淋巴瘤**的**。

動物實驗通過靜脈注射使用的是靶向肝細胞的Acuitas LNP。小鼠單次給藥40 μg產(chǎn)生的血清抗體水平剛剛超過10 μg/ml，1個月后逐漸下降到1 μg/ml。相同劑量下，VHH單結(jié)構(gòu)域中和劑產(chǎn)生的抗體水平高10倍，但由于缺乏Fc區(qū)，半衰期*有幾天。當在狂犬病病毒的致命攻擊之前1天或之后2小時，對小鼠單次靜脈注射40 μg也能夠完全保護小鼠。

同樣，在致命的肉毒桿菌**攻擊后6小時單次給藥40 μg也完全保護了動物。第三個攻擊模型是將Raji-luc2 B細胞淋巴瘤細胞靜脈移植并且生長4天，然后在18天內(nèi)，在Acuitas LNP中5次給藥10或50 μg mRNA編碼的利妥昔單抗，結(jié)果是保護了所有動物，并且50 μg劑量能夠完全消除**生長。

將T細胞募集到**細胞的雙特異性抗體也被編碼在修飾的mRNA結(jié)構(gòu)中，并使用商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑TransIT在體內(nèi)遞送，該試劑在肝臟遞送方面不如目前的LNP有效。

該mRNA結(jié)構(gòu)可維持循環(huán)和生物活性的雙特異性抗體超過6天，而相同5 μg劑量的蛋白質(zhì)-雙特異性抗體在**后減少至接近基線。第二項研究也是使用VHH形式的雙特異性抗體進行的，其中一個結(jié)合保守的甲型流感基質(zhì)蛋白2外域(M2e)的VHH基因與另一個小鼠Fcγ受體IV (FcγRIV) 特異性結(jié)合的VHH基因相連，以便將表達FcγRIV的先天免疫細胞募集到表達M2e的流感感ran細胞中。

這些核苷修飾過結(jié)構(gòu)的mRNA使用DOTAP/膽固醇制備的LNPs遞送，通過氣管內(nèi)滴注到小鼠肺中，4小時后，用致死劑量的流感病毒攻擊，80%的小鼠免受致死劑量的影響，盡管它們產(chǎn)生明顯的體重減輕，并且DOTAP/膽固醇mRNA納米粒導(dǎo)致粒細胞暫時流入肺部，同時血清IL-6細胞因子水平也有所升高。

**，在基孔肯雅感ran幸存者的B細胞中發(fā)現(xiàn)的一種有效中和抗體被編碼在一種核苷修飾的mRNA結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)由一個可能含有MC3或脂質(zhì)5的LNP遞送。靜脈注射0.5 mg/kg(10 μg)編碼mAb的mRNA，24小時預(yù)注射的小鼠獲得了抗病毒攻擊的保護作用，而注射蛋白mAb需要2 mg/kg的劑量。在感ran后4小時，對小鼠注射高劑量10 mg/kg (200 μg)，使小鼠避免感ran。非人的靈長類動物研究中發(fā)現(xiàn)，3 mg/kg(9 mg)的高劑量產(chǎn)生的短暫毒性（包括脾臟增大和CCL2血清水平升高）最小，且注射后幾個月仍可檢測到抗體?；谶@些結(jié)果，Moderna啟動了一項1期臨床試驗，并公布了陽性結(jié)果，其中0.1和0.3 mg/kg的劑量耐受性良好，并且mAb的血清水平在1–14 μg/mL的范圍內(nèi)，預(yù)計單次給藥后可對基孔肯雅病毒具有長達16周的免疫作用。

脂質(zhì)納米顆粒組裝和結(jié)構(gòu)

目前mRNA脂質(zhì)納米顆粒的生產(chǎn)方法是利用微流體或T型接頭，把含有疏水性質(zhì)的乙醇相和含有mRNA的水相在pH為4的緩沖液（如乙酸）中混合（圖2）?，F(xiàn)有的方法（如薄膜蒸發(fā)法和乙醇注入法），由于納米粒子粒徑不穩(wěn)定、mRNA包封率較低、難以擴大規(guī)模而很少使用。微流體混合的優(yōu)點是能夠?qū)⒁掖贾蟹浅Ｐ◇w積的脂質(zhì)與幾十μL水溶液中的mRNA混合，從而可以篩選許多成分和方參數(shù)。另一方面，T型接頭混合器是大批量商業(yè)生產(chǎn)mRNA LNPs的通用方法，例如目前臨床試驗中使用的方法。

最近的一份期刊表明，這兩種方法都可以生產(chǎn)有類似大小和形態(tài)的LNP。兩種溶液的快速混合是控制粒徑< 100 nm的關(guān)鍵，從而避免了其他生產(chǎn)方法所需的尺寸減小的需要(擠出、超聲處理)。如圖2所示，由這些溶液組裝和形成LNP的過程是由疏水力和靜電力驅(qū)動的。四種脂質(zhì)(可電離脂質(zhì)、DSPC、膽固醇、PEG-脂質(zhì))最初可溶于乙醇，可電離脂質(zhì)非質(zhì)子化且呈電中性(圖2A)。通常將一體積的含脂質(zhì)的乙醇溶液與三體積的mRNA在pH=4的醋酸鹽緩沖液中混合，這使得脂質(zhì)接觸緩沖液時，它們變得不溶于3∶1的水/乙醇溶劑，并且可電離的脂質(zhì)質(zhì)子化攜帶正電荷，然后與mRNA的帶負電荷的磷酸骨架靜電結(jié)合(圖2B)，形成包封mRNA的脂質(zhì)顆粒，同時脂質(zhì)在主要是水的懸浮液中變得難溶。

這一過程中的一個關(guān)鍵成分是PEG-脂質(zhì)，因為PEG鏈是親水性的，從而包覆顆粒，并決定其最終的熱力學(xué)穩(wěn)定尺寸大小。通過改變PEG的摩爾分數(shù)，可以控制LNP的大小，例如，LNP顆粒大小為100 nm時PEG-脂質(zhì)的摩爾分數(shù)為0.5%，而43 nm時PEG-脂質(zhì)的摩爾分數(shù)為3%。最近一個研究顯示，當mRNA LNP懸浮液在水溶液緩沖液中稀釋或透析以提高pH并去除乙醇時，LNP的結(jié)構(gòu)和大小在混合后繼續(xù)發(fā)生變化。水相和脂質(zhì)相混合時初始pH值接近5.5，使可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，其LNP的pKa接近6.5，可以與mRNA結(jié)合和包裹(圖2B，C)。

之后通過稀釋、透析或切向流過濾提高pH可以中和可電離脂質(zhì)，直到pH為7.4時可電離脂質(zhì)基本不帶電(圖2D)。當可電離脂質(zhì)變?yōu)殡娭行詴r，它也變得更難溶解，導(dǎo)致形成更大的疏水類脂結(jié)構(gòu)域，從而促進LNP的融合，使LNP的尺寸增大，LNP的中心形成無定形的電子致密相，主要包含與mRNA結(jié)合的可電離脂質(zhì)。據(jù)估計，在這個過程中，多達36個囊泡可以融合形成最終的LNP(圖2C，D)。使用FRET對證實了這一融合過程，并進一步看到了PEG-脂質(zhì)在這一過程中的作用，因為混合后加入PEG-脂質(zhì)與混合前加入PEG-脂質(zhì)以相同的方式控制最終LNP的大小。這項研究和另一項使用中子散射方法的研究也表明，DSPC在LNP的**PEG層的下面形成了一個雙層結(jié)構(gòu)，其**主要是與mRNA結(jié)合的可電離脂質(zhì)(圖2D)，同時認為膽固醇分布在整個LNP中。

圖2：mRNA脂質(zhì)納米顆粒的組裝是通過(A)在微流體或T型接頭混合器中將四種脂質(zhì)(可電離脂質(zhì)、DSPC、膽固醇、PEG-脂質(zhì))在乙醇中與mRNA在pH4左右的水溶液緩沖液中快速混合而實現(xiàn)的。

(B)當可電離脂質(zhì)與水相接觸時，在pH~5.5范圍內(nèi)質(zhì)子化，該pH介于緩沖液的pKa和可電離脂質(zhì)的pKa之間。

(C)可電離脂質(zhì)與mRNA的陰離子磷酸骨架靜電結(jié)合，同時它在水相中經(jīng)歷具有疏水性，驅(qū)動囊泡的形成和mRNA的包裹。

(D)在初始囊泡形成后，通過稀釋、透析或過濾提高pH，中和可電離脂質(zhì)，使其疏水性增強，從而驅(qū)動囊泡融合，導(dǎo)致可電離脂質(zhì)與mRNA進一步包裹在脂質(zhì)納米粒的內(nèi)部。通過給LNP提供親水性的外表、確定其熱力學(xué)穩(wěn)定的尺寸大小，PEG-脂質(zhì)的含量停止融合，在PEG-脂質(zhì)層的下面形成DSPC的雙層結(jié)構(gòu)。

疫苗的mRNA遞送系統(tǒng)性能的決定性因素

mRNA遞送系統(tǒng)的性能決定因素是多因素且相互作用的，包括：(1)它們向靶細胞遞送的能力，并將mRNA有效地釋放至細胞質(zhì)并進行翻譯的效率；(2)佐劑，可以增強免疫反應(yīng)；(3)將注射部位或全身分布的過度炎癥和脫靶表達可能引起的不良反應(yīng)或毒性降至低。

劑量

目前在SARS-CoV-2臨床試驗中追求的大劑量范圍給藥（從1 μg到100 μg），能夠評價mRNA遞送系統(tǒng)的效率(表1)。臨床試驗中的劑量主要分為較高劑量（30-100 μg）的核苷修飾RNA(Moderna，BioNTech)，較低劑量（7.5-20 μg）的未修飾的RNA(CureVac，Translate Bio)，甚至更低劑量（1-10 μg）的自擴增RNA(Arcturus，倫敦帝國理工學(xué)院)。

決定這些劑量的因素有兩個：與恢復(fù)期血漿相比，中和抗體效價和T細胞反應(yīng)水平，以及在每個劑量下發(fā)生不良反應(yīng)的頻率和嚴重程度。第一階段臨床試驗中所有高劑量實驗的中止就證明了SARS-CoV-2疫苗有一個相當狹窄的接受窗口，達到保護所需的劑量產(chǎn)生了難以接受的不良反應(yīng)的頻率和嚴重程度。在BioNTech第一階段臨床試驗中測試的兩種核苷修飾的RNA與恢復(fù)期血漿相比，具有較高的中和效價，而由于編碼膜結(jié)合的全長刺突蛋白的較大結(jié)構(gòu)RNA發(fā)生不良反應(yīng)的頻率和嚴重程度較低，因此進行了第三階段臨床研究。值得注意的是，劑量以質(zhì)量表示，而摩爾劑量取決于結(jié)構(gòu)的長度，而且，根據(jù)遞送系統(tǒng)的效率和靶向特性，實際翻譯的mRNA量只是兩者中的一小部分。

在預(yù)防傳染病的mRNA疫苗的動物研究中，當使用魚精蛋白、樹枝狀大分子和早期陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)時，在小鼠中能夠產(chǎn)生中和抗體或抵御病毒的初始劑量高達10-80 μg(表3)。當之后使用*近的LNPs遞送的mRNA疫苗時，小鼠中和所需的劑量在給藥兩次時降低到接近1 μg，而對于未修飾的mRNA，所需劑量更低，接近0.25 μg。對于自我擴增的mRNA，劑量可以更低，只需要兩次給藥0.1 μg或一次給藥2 μg。在較大的動物模型(倉鼠、雪貂和非人的靈長類動物)中，可用的研究較少，劑量范圍很廣，從5 μg到200 μg，沒有明顯的模式。

有趣的是，當使用體表面積將人的劑量轉(zhuǎn)換為動物的劑量時，60 kg人的100 μg劑量相當于3 kg獼猴的15 μg劑量和20 g小鼠的0.4 μg劑量，這兩個數(shù)據(jù)與表1和表3中的LNPs大致相同。顯然，給藥系統(tǒng)在確定有效劑量方面起著重要作用。人們強烈希望提高給藥效率，以減少劑量和維持效價，因為這有望通過減少mRNA和給藥載體的局部反應(yīng)和脫靶效應(yīng)來降低不良反應(yīng)的頻率和嚴重程度。減少劑量還將降低每個人接種疫苗所需的原材料數(shù)量和相關(guān)成本。特別是當前的COVID-19大流行使人們關(guān)注到mRNA LNP疫苗的一些重大供應(yīng)鏈和生產(chǎn)能力的限制，這一狀況可以通過更有效的遞送系統(tǒng)加以改善。

表3：體內(nèi)預(yù)防性接種的mRNA劑量。不同的mRNA傳遞系統(tǒng)和不同的物種顯示了誘導(dǎo)中和抗體效價或抵御病毒攻擊所需的mRNA的劑量。與早期的遞送系統(tǒng)相比，脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)遞送的mRNA的所需劑量減少了10倍。

效價和遞送效率

已經(jīng)有許多研究試圖確定LNP和其他核酸遞送系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系。決定其效價或傳遞效率的LNP*常用的參數(shù)是pKa。pKa是使LNP中50%的可電離脂質(zhì)質(zhì)子化時的pH。到目前為止，LNP的pKa通過一種叫TNS的染料來測定，TNS是帶負電荷的，當與帶正電荷的LNP結(jié)合時，產(chǎn)生熒光增效果好果。

用TNS培養(yǎng)的LNPs在pH范圍較大的緩沖液內(nèi)進行熒光測量，以推斷染料與表面電荷的結(jié)合，估算pKa，發(fā)現(xiàn)達到了大熒光的一半。眾所周知，基于MC3的Onpattro LNP在靜脈注射后使肝細胞沉默的佳pKa為6.4。TNS的pKa在6.2-6.8范圍內(nèi)對任何一種LNP都有一個肝細胞沉默的佳值。解釋這種依賴于pKa的原理是基于LNP的可電離脂質(zhì)在pH為7.4時接近中性，而在它進入細胞后，內(nèi)涵體的pH值隨著內(nèi)涵體途徑的演變而開始下降，使可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，而可電離脂質(zhì)又將結(jié)合到內(nèi)涵體的一個陰離子內(nèi)源性磷脂上并且破壞其雙層結(jié)構(gòu)，從而將mRNA釋放到細胞質(zhì)中用于核糖體翻譯表達蛋白。

內(nèi)涵體逃逸需要可電離脂質(zhì)的另一個特征，即錐形的形態(tài)，其中脂質(zhì)尾部的橫截面大于其頭部。這使得可電離的脂質(zhì)/內(nèi)涵體磷脂離子對和雙層結(jié)構(gòu)不相容，并且更有可能形成倒六邊形的結(jié)構(gòu)，從而破壞內(nèi)涵體的膜結(jié)構(gòu)。這也被稱為分子形狀假說，它解釋了為什么在飽和的C18烷基鏈上引入一個或兩個雙鍵會產(chǎn)生更多的錐形和更少的圓柱形的形態(tài)，即膜的破壞和內(nèi)涵體逃逸。

這兩個C18亞油酸的尾部，與二甲胺頭部的適當?shù)?、調(diào)節(jié)好的pKa結(jié)合，是MC3可電離脂質(zhì)所定義的特征。取代MC3用于mRNA傳遞的可電離脂質(zhì)保留了pKa的要求，但通過在烷基尾部引入更多的支鏈來追求更大的內(nèi)涵體裂解特性。例如，來自Moderna的脂質(zhì)H和脂質(zhì)5和Arcturus的脂質(zhì)2，2(8，8)4C CH3一樣，有三個烷基尾部，而Acuitas的ALC-0315有四個烷基尾部，A9有五個烷基尾部(表2)。這種增強的錐形形態(tài)解釋了含有這些可電離脂質(zhì)的LNPs是更有效的遞送載體，具有更強的內(nèi)涵體逃逸。

雖然LNP的pKa和分子形狀假說對LNP的遞送效率有很好的貢獻，但其他因素也很重要，如LNP表面PEG-脂質(zhì)的穩(wěn)定性，以及四種脂質(zhì)在乙醇溶液中的比例，這些因素*終決定了LNP的超微結(jié)構(gòu)。如上所述，PEG-脂質(zhì)通過提供親水性外殼來控制LNP的大小，該外殼在組裝過程中限制囊泡融合，從而使較高的PEG-脂質(zhì)濃度產(chǎn)生較小的LNP。

如一項研究表明，將PEG-脂質(zhì)的摩爾分數(shù)從0.25%改變到5%，可以將LNP的大小從117 nm減少到25 nm，而當使用摩爾分數(shù)為2.5%的PEG-脂質(zhì)時，肝細胞沉默的佳粒徑大小是78 nm。由于PEG-脂質(zhì)的烷基尾部有14個碳，它不能穩(wěn)定地固定在LNP表面，隨著可電離脂質(zhì)MC3和DSPC的脫落，它逐漸在循環(huán)中從LNP上脫落。這種PEG脫落被認為在一定程度上使LNP轉(zhuǎn)染有效，但如果脫落過強，會導(dǎo)致可電離脂質(zhì)和DSPC的迅速喪失，這將對內(nèi)涵體逃逸產(chǎn)生不利的影響。

例如，通過將烷基尾部延伸到18個碳，PEG-脂質(zhì)不會脫落，但在肝細胞中也沒有被沉默。另一方面，加入較高濃度的PEG使顆粒變得更小，會導(dǎo)致更快的脫落、可電離脂質(zhì)丟失、并且減少沉默基因效果。目前，人們對LNP的不穩(wěn)定和動態(tài)性質(zhì)不完全了解。另一項研究（與上面提到的研究類似）還發(fā)現(xiàn)，用1.5%的PEG-脂質(zhì)制備的中等直徑64 nm的LNP比更大直徑（100 nm）的LNP(0.5%PEG脂質(zhì))以及更小直徑（48 nm）LNP(3%PEG脂質(zhì))能更有效地遞送mRNA。

然而，通過改變四種脂質(zhì)的摩爾比，在1.5%PEG-脂質(zhì)、直徑64 nm的LNP中，以保持計算出的LNP PEG層下的DSPC密度為佳值，這樣能夠制備更大尺寸的的（100 nm）LNP，其mRNA表達與64 nm的LNP相比增加了兩倍。因此，除了LNP的pKa、可電離脂質(zhì)的分子形狀和PEG-脂質(zhì)的動力學(xué)之外，更詳細的LNP超微結(jié)構(gòu)特征和每個組分的狀態(tài)也決定了其效價。

內(nèi)涵體逃逸

對siRNA-LNPs的細胞攝取和內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運進行了詳細的研究，并假設(shè)其與mRNA LNPs的細胞攝取和內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運相似。一項使用電子顯微鏡中金溶膠粒子計數(shù)的定量研究表明，對于MC3 LNP，內(nèi)涵體中只有2%的siRNA從內(nèi)涵體逃逸到胞漿中，導(dǎo)致每個細胞中有幾千個siRNA分子可供沉默。

然而，這個數(shù)字與在**相關(guān)濃度下每個細胞RISC與有功能活性的siRNA的相互作用估計水平的范圍相同。因此，絕大多數(shù)siRNA注定要進行溶酶體降解或通過多囊體(晚期內(nèi)涵體)循環(huán)在體外進行釋放。增加LNPs的內(nèi)涵體逃逸是提高給藥效率的主要途徑，主要是通過調(diào)節(jié)LNP的pKa和增加可電離脂質(zhì)的錐形形態(tài)來實現(xiàn)的。

對于后者，脂質(zhì)H和脂質(zhì)5含有三個分支，而在MC3中只有兩個分支，但具有相似的PKA，與MC3相比，它們的內(nèi)涵體逃逸率變?yōu)樵瓉淼乃谋丁Ｄ壳斑€沒有報道Acuitas ALC-0315的內(nèi)涵體逃逸情況，但Acuitas ALC-0315的肝細胞沉默效率是MC3的10倍，這表明其更具有錐形的四分支結(jié)構(gòu)也有更強的內(nèi)涵體逃逸。

因此，這些新一代的可電離脂質(zhì)似乎實現(xiàn)了內(nèi)涵體逃逸率，與MC3 siRNA-LNPs的2-5%相比，接近15%或更高。這一領(lǐng)域的挑戰(zhàn)之一是缺乏可廣實施的可靠、標準化的內(nèi)涵體逃逸方法。目前已經(jīng)開發(fā)了許多方法，但通常只針對一個實驗室組。*近還發(fā)現(xiàn)，mRNA發(fā)生胞吐的量與釋放到胞漿中的量相似。MC3 LNPs在MC3的晚期內(nèi)涵體和NP1復(fù)合體中被解離，MC3LNPs和mRNA被重新包裹成外泌體，并從細胞中輸出。這些內(nèi)-外泌體與*初的MC3 LNPs具有相似的mRNA遞送能力，但內(nèi)-外泌體可以運輸?shù)讲煌慕M織，且似乎免疫**能力較低。LNPs攜帶的mRNA的外泌體重新分布的潛在意義仍有待探索。

電荷和配體介導(dǎo)的靶向

使用**帶電的陽離子脂質(zhì)的早期脂質(zhì)納米顆粒很大，由于它們的**帶正電荷，很快就被**，并且他們通常是以肺部為靶點。BioNTech的研究小組減少了DOTMA/Dope mRNA LNPs中陽離子DOTMA的數(shù)量，直到由于NP比小于1的陰離子mRNA過量而導(dǎo)致凈電荷帶負電。

靜脈注射這些帶負電荷的且長度為300 nm的mRNA LNPs可以導(dǎo)致脾臟靶向和樹突狀細胞的mRNA表達，它們能夠介導(dǎo)適應(yīng)性和I型干擾素介導(dǎo)的先天免疫機制用于**免疫**。同樣，用C12-200原型LNP生產(chǎn)脾靶向的mRNA LNP，但用小的、樹枝狀的可電離脂質(zhì)Cf-Deg-Lin代替C12-200，Cf-Deg-Lin具有四個亞油酸烷基鏈和四個氮原子，TNS pKa為5.7。LNP的這種極低的pKa將確保可電離脂質(zhì)在pH低于7之前不被質(zhì)子化，從而制備出一種包載帶負電荷的mRNA的LNP，直到內(nèi)涵體途徑晚期，并輸送到脾臟。

他們發(fā)現(xiàn)脾臟中表達mRNA的主要細胞群是B淋巴細胞，根據(jù)流式細胞術(shù)分析，其中7%的B淋巴細胞表達mRNA。*近，利用三種不同的堿性(MC3、C12-200或5A2-SC8)作為可電離脂質(zhì)，混合在一定摩爾分數(shù)的**性陽離子脂質(zhì)(DOTAP)或**性陰離子脂質(zhì)(18PA)中，使LNPs具有凈正電荷、凈負電荷或凈中性電荷，從而實現(xiàn)了荷電靶向。與上述發(fā)現(xiàn)一致